ชุด CHO HCP ELISA
วิธี ELISA อิมมูโนซอร์เบนท์แบบขั้นตอนเดียวถูกนำมาใช้ในการสอบวิเคราะห์นี้ตัวอย่างที่มี CHOK1 HCP ทำปฏิกิริยาพร้อมกันกับแอนติบอดีต้าน CHOK1 ของแพะที่มีฉลาก HRP และแอนติบอดีต้าน CHOK1 ที่เคลือบบนเพลต ELISA ในที่สุดก็ก่อตัวเป็นสารเชิงซ้อนแบบแซนวิชของแอนติบอดีที่มีฉลาก HCP ของแอนติบอดีเฟสแข็งแอนติเจน-แอนติบอดีที่ไม่ถูกผูกไว้สามารถกำจัดออกได้โดยการล้างแผ่น ELISAสารตั้งต้น TMB ถูกเติมลงในหลุมเพื่อให้เกิดปฏิกิริยาเพียงพอการพัฒนาสีจะหยุดลงหลังจากเติมสารละลายหยุด และค่า OD หรือค่าการดูดกลืนแสงของสารละลายปฏิกิริยาที่ 450/650 นาโนเมตรจะถูกอ่านด้วยเครื่องอ่านไมโครเพลทค่า OD หรือค่าการดูดกลืนแสงเป็นสัดส่วนกับปริมาณ HCP ในสารละลายจากนี้ ความเข้มข้นของ HCP ในสารละลายสามารถคำนวณได้ตามกราฟมาตรฐาน
แอปพลิเคชัน
ชุดอุปกรณ์นี้ใช้เพื่อตรวจจับปริมาณสารตกค้างของโปรตีนเซลล์เจ้าบ้าน CHOK1 ในตัวอย่าง
Cส่วนประกอบ
| เอส/เอ็น | ส่วนประกอบ | ความเข้มข้น | สภาพการเก็บรักษา |
| 1 | CHOK1 มาตรฐาน HCP | 0.5มก./มล | ≤–20 ℃ |
| 2 | ต่อต้าน CHO HCP-HRP | 0.5มก./มล | ≤–20°C ป้องกันแสง |
| 3 | ทีเอ็มบี | NA | 2-8 ℃ ป้องกันแสง |
| 4 | 20 × PBST 0.05% | NA | 2-8 ℃ |
| 5 | หยุดการแก้ปัญหา | NA | RT |
| 6 | เครื่องซีลไมโครเพลท | NA | RT |
| 7 | บีเอสเอ | NA | 2-8 ℃ |
| 8 | แผ่นเคลือบล่วงหน้าการดูดซับสูง | NA | 2-8 ℃ |
อุปกรณ์ที่จำเป็น
| วัสดุสิ้นเปลือง/อุปกรณ์ | การผลิต | แคตตาล็อก |
| เครื่องอ่านไมโครเพลท | อุปกรณ์โมเลกุล | Spectra Max M5, M5e หรือเทียบเท่า |
| เทอร์โมมิกเซอร์ | เอพเพนดอร์ฟ | Eppendorf/5355 หรือเทียบเท่า |
| เครื่องผสมน้ำวน | ไอเคเอ | MS3 ดิจิทัลหรือเทียบเท่า |
การจัดเก็บและความมั่นคง
1.ขนส่งที่อุณหภูมิ -25~-15°C
2.สภาพการเก็บรักษาดังแสดงในตารางที่ 1;ส่วนประกอบ 1-2 ถูกเก็บไว้ ≤–20°C, 5-6 ถูกเก็บไว้ RT,3、4、7、8 จะถูกเก็บไว้ที่ 2-8 ℃;ระยะเวลาที่ถูกต้องคือ 12 เดือน
พารามิเตอร์ผลิตภัณฑ์
1-ความไว: 1ng/มล
2.ช่วงการตรวจจับ: 3- 100ng/mL
3.ความแม่นยำ: การทดสอบภายใน CV≤ 10%, การทดสอบระหว่าง CV≤ 15%
4.ความครอบคลุมของ HCP: >80%
5.ความจำเพาะ: ชุดนี้เป็นแบบสากลเนื่องจากทำปฏิกิริยากับ CHOK1 HCP โดยเฉพาะโดยไม่ขึ้นอยู่กับกระบวนการทำให้บริสุทธิ์
การเตรียมรีเอเจนต์
1.พีบีเอสที 0.05%
ใช้ 20×PBST 0.05% 15 มล. เจือจางใน ddH2O และทำได้ถึง 300 มล.
2.บีเอสเอ 1.0%
นำ BSA 1 กรัมจากขวด และเจือจาง PBST 0.05% 100 มล. ผสมให้เข้ากันจนละลายหมด และเก็บที่อุณหภูมิ 2-8°Cบัฟเฟอร์การเจือจางที่เตรียมไว้มีอายุ 7 วันแนะนำให้เตรียมตามความจำเป็น
3.สารละลายการตรวจจับ 2ไมโครกรัม/มิลลิลิตร
ใช้ Anti-CHO HCP-HRP 48μL 0.5 มก./มล. และเจือจางใน 11,952μL ของ 1% BSA เพื่อให้ได้ความเข้มข้นสุดท้ายเป็นสารละลายการตรวจจับ 2μg/mL
4.การควบคุมคุณภาพและการจัดทำมาตรฐาน CHOK1 HCP
| หลอด เลขที่ | ต้นฉบับ | ความเข้มข้น | ปริมาณ | บีเอสเอ 1% | ปริมาณรวม | สุดท้าย |
| A | มาตรฐาน | 0.5มก./มล | 10 | 490 | 500 | 10,000 |
| B | A | 10,000 | 50 | 450 | 500 | 1,000 |
| S1 | B | 1.000 | 50 | 450 | 500 | 100 |
| S2 | S1 | 100 | 300 | 100 | 400 | 75 |
| S3 | S2 | 75 | 200 | 175 | 375 | 40 |
| S4 | S3 | 40 | 150 | 350 | 500 | 12 |
| S5 | S4 | 12 | 200 | 200 | 400 | 6 |
| S6 | S5 | 6 | 200 | 200 | 400 | 3 |
| NC | NA | NA | NA | 200 | 200 | 0 |
| QC | S1 | 100 | 50 | 200 | 250 | 20 |
ตารางการจัดทำ QC และมาตรฐาน
ขั้นตอนการทดสอบ
1.เตรียมรีเอเจนต์ตามที่ระบุไว้ใน “การเตรียมรีเอเจนต์” ด้านบน
2.นำสารมาตรฐาน ตัวอย่าง และ QC จำนวน 50μL (ดูตารางที่ 3) ลงในแต่ละหลุม จากนั้นเติมสารละลายการตรวจจับ 100μL (2μg/mL)ปิดแผ่นด้วยเครื่องซีล และวางแผ่น ELISA ลงบนเทอร์โมมิกเซอร์ฟักไข่ที่ 500rpm, 25±3°C เป็นเวลา 2 ชั่วโมง
3.กลับด้านไมโครเพลทในอ่างล้างจานแล้วทิ้งสารละลายเคลือบไปปิเปต 300μL ของ PBST 0.05% ลงในแต่ละหลุมเพื่อล้างเพลต ELISA และทิ้งสารละลาย และล้างซ้ำ 3 ครั้งกลับด้านจานบนผ้ากระดาษสะอาดแล้วซับให้แห้ง
4.เติมซับสเตรตของ TMB 100μL (ดูตารางที่ 1) ลงในแต่ละหลุม ปิดผนึกแผ่น ELISA และบ่มในที่มืดที่ 25±3°C เป็นเวลา 15 นาที
5.ปิเปต 100μL ของสารละลายหยุดลงในแต่ละหลุม
6.วัดการดูดกลืนแสงที่ความยาวคลื่น 450/650 นาโนเมตรด้วยเครื่องอ่านไมโครเพลท
7.วิเคราะห์ข้อมูลด้วย SoftMax หรือซอฟต์แวร์ที่เทียบเท่าพล็อตเส้นโค้งมาตรฐานโดยใช้แบบจำลองการถดถอยโลจิสติกสี่พารามิเตอร์
ตัวอย่างเส้นโค้งมาตรฐาน
หมายเหตุ: หากความเข้มข้นของ HCP ในตัวอย่างเกินขีดจำกัดด้านบนของเส้นโค้งมาตรฐาน จะต้องเจือจางอย่างเหมาะสมด้วยบัฟเฟอร์การเจือจางก่อนการทดสอบ
หมายเหตุ
สารละลายหยุดคือกรดซัลฟิวริก 2M โปรดจัดการด้วยความระมัดระวังเพื่อหลีกเลี่ยงการกระเด็น!
