ชุดมินิสกัด DNA
ชุดนี้ใช้ระบบบัฟเฟอร์ที่ได้รับการปรับปรุงและเทคโนโลยีการทำให้คอลัมน์ซิลิกาเจลบริสุทธิ์ ซึ่งสามารถกู้คืนชิ้นส่วน DNA ขนาด 70 bp – 20 kb จากเจล TAE หรือ TBE agarose ที่มีความเข้มข้นต่างๆคอลัมน์การดูดซับ DNA สามารถดูดซับ DNA เป็นพิเศษภายใต้สภาวะที่มีเกลือสูงนอกจากนี้ ชุดอุปกรณ์ยังสามารถทำให้ชิ้นส่วน DNA บริสุทธิ์จากผลิตภัณฑ์ PCR, ระบบปฏิกิริยาของเอนไซม์ หรือผลิตภัณฑ์ DNA อย่างหยาบที่ได้จากวิธีอื่นได้โดยตรง และกำจัดสิ่งเจือปน เช่น โปรตีน สารประกอบอินทรีย์อื่นๆ เกลืออนินทรีย์ไอออน และไพรเมอร์โอลิโกนิวคลีโอไทด์สามารถมั่นใจได้ว่าการทำให้บริสุทธิ์จะแล้วเสร็จภายใน 10-15 นาทีDNA บริสุทธิ์สามารถนำมาใช้โดยตรงสำหรับ ligation, การเปลี่ยนแปลง, การย่อยของเอนไซม์, การถอดรหัสในหลอดทดลอง, PCR, การเรียงลำดับ, การฉีดขนาดจิ๋ว ฯลฯ
สภาพการเก็บรักษา
เก็บที่อุณหภูมิ -15 ~ -25 ℃ และขนส่งที่อุณหภูมิห้อง
ส่วนประกอบ
| ส่วนประกอบ | (100 rxns) |
| บัฟเฟอร์ GDP | 80 มล |
| บัฟเฟอร์ GW | 2 × 20 มล |
| บัฟเฟอร์การชะล้าง | 20 มล |
| FastPure DNA Mini Columns-G | 100 |
บัฟเฟอร์ GDP:บัฟเฟอร์การจับ DNA
บัฟเฟอร์ GW:บัฟเฟอร์ซักผ้า;เติมเอทานอลสัมบูรณ์ตามปริมาตรที่ระบุบนขวดก่อนใช้งาน
บัฟเฟอร์การชะล้าง:ชะล้าง
FastPure DNA Mini Columns-G:คอลัมน์ดูดซับดีเอ็นเอ
หลอดคอลเลกชัน 2 มล.:หลอดรวบรวมสำหรับการกรอง
วัสดุที่เตรียมไว้
หลอดฆ่าเชื้อ 1.5 มล. เอทานอลสัมบูรณ์ และไอโซโพรพานอล (เมื่อชิ้นส่วน DNA น้อยกว่า 100 bp ให้เติม 1 ปริมาตร
ไอโซโพรพานอลต่อเจล 1 ปริมาตร) อ่างน้ำ
กระบวนการทดลอง
เติมเอทานอล 80 มล. เพื่อเจือจางบัฟเฟอร์ GW ตามที่ระบุไว้บนแท็กก่อนใช้งาน เก็บที่อุณหภูมิห้อง
กลไก
1. สารละลายปฏิกิริยา PCR
รูปแบบการสกัดเจล: เพิ่มแผนการกู้คืนสารละลายบัฟเฟอร์ GDP PCR ในปริมาณเท่ากัน:เพิ่มบัฟเฟอร์ปริมาตร 5 เท่า
2. GDP คำนวณปริมาตรของเจล(100 μลิตร เท่ากับ 100 มก. )
ละลายเจล
3. เปิดเตาที่ 50 ~ 55℃
4. ผูกล้าง
เพิ่ม 300 μL ของบัฟเฟอร์ GDP*
เติมบัฟเฟอร์ GW 700 ไมโครลิตร
เติมบัฟเฟอร์ GW 700 ไมโครลิตร
5. อภิสิทธิ์
เติม Elution Buffer หรือน้ำปราศจากไอออน 20 – 30μL
หมายเหตุ* การกู้คืนของเหลวปฏิกิริยา PCR โดยไม่มีขั้นตอนนี้
โปรแกรมสกัดเจล
1. หลังจาก DNA electrophoresis เพื่อแยกชิ้นส่วน DNA ให้ตัดแถบ DNA แถบเดียวออกจากเจล agarose ภายใต้แสง UVขอแนะนำให้ใช้กระดาษดูดซับเพื่อดูดซับความชื้นที่ปรากฏของเจล และลดขนาดของชิ้นเจลให้เหลือน้อยที่สุดโดยการกำจัดอะกาโรสส่วนเกินออกให้ได้มากที่สุดชั่งน้ำหนักชิ้นเจล (โดยไม่ใช้หลอดไมโครเซนตริฟิวจ์) เพื่อคำนวณปริมาตร: ปริมาตรของชิ้นเจล 100 มก. จะอยู่ที่ประมาณ 100 ไมโครลิตร โดยสมมติว่าความหนาแน่นคือ 1 กรัม/มิลลิลิตร
2. เพิ่ม Buffer GDP ในปริมาตรเท่ากัน ฟักที่ 50~55°C เป็นเวลา 7-10 นาที (ตามขนาดเจล ให้ปรับเวลาฟักตัวจนกว่าเจลจะละลายหมด)กลับด้านท่อ 2 ครั้งระหว่างการฟักตัว
Δ การเพิ่มบัฟเฟอร์ GDP 1-3 เล่มจะไม่ส่งผลต่อประสิทธิภาพการกู้คืน DNAหากชิ้นส่วน DNA ที่จะกู้คืน <100 bp จะต้องเพิ่ม Buffer GDP 3 ปริมาตรเมื่อชิ้นเจลละลายหมด ให้เติมไอโซโพรพานอล 1 ปริมาตรแล้วผสมให้เข้ากัน จากนั้นทำตามขั้นตอนต่อไป
3. ปั่นแยกเป็นเวลาสั้นๆ เพื่อนำตัวอย่างไปไว้ที่ด้านล่างของหลอด ใส่ FastPure DNA Mini Columns-G ลงในหลอดเก็บตัวอย่างขนาด 2 มล. จากนั้นถ่ายสารละลายอย่างระมัดระวังสูงสุดที่ 700 μL หนึ่งครั้งต่อครั้ง
ถึงเวลาคอลัมน์การกรอง ปั่นแยกที่ 12,000 รอบต่อนาที (13,800 X g) เป็นเวลา 30-60 วินาที
4. ทิ้งตัวกรองแล้วเติม Buffer GDP 300 μL ลงในคอลัมน์ ฟักที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 1 นาที ปั่นแยกที่ 12,000 rpm (13,800 X g) เป็นเวลา 30-60 วินาที
5. ทิ้งตัวกรองและเติม Buffer GW 700 μL (ตรวจสอบว่าได้เติมเอธานอลสัมบูรณ์ไว้ล่วงหน้าหรือไม่!) ลงในคอลัมน์ โดยปั่นแยกที่ 12,000 rpm (13,800 X g) เป็นเวลา 30-60 วินาที
Δ กรุณาเติม Buffer GW รอบผนังเสาดูดซับ หรือเพิ่ม Buffer GW ฝาหลังแล้วผสมกลับด้าน 2 – 3 ครั้งเพื่อช่วยชะล้างเกลือที่เกาะติดกับผนังท่อให้หมด
6. ทำซ้ำขั้นตอนที่ 5
Δ การล้างด้วยบัฟเฟอร์ GW สองครั้งช่วยให้มั่นใจได้ว่าเกลือจะถูกกำจัดออกไปจนหมด และขจัดผลกระทบต่อการทดลองครั้งต่อไป
7. ทิ้งตัวกรองและปั่นเหวี่ยงคอลัมน์เปล่าที่ 12,000 รอบต่อนาที (13,800 X g) เป็นเวลา 2 นาที
8. ใส่คอลัมน์ลงในหลอดไมโครเซนตริฟิวจ์ขนาด 1.5 มล. ที่สะอาด เติม Elution Buffer 20 - 30 µL ที่กึ่งกลางของเมมเบรนของคอลัมน์ บ่มเป็นเวลา 2 นาที จากนั้นปั่นแยกที่ 12,000 rpm (13,800 X g) เป็นเวลา 1 นาทีทิ้งคอลัมน์ เก็บ DNA ที่ได้รับไว้ที่ -20 .
Δ ถ่ายโอนส่วนเหนือตะกอนของขั้นตอนที่ 8 ไปยังคอลัมน์เพื่อชะอีกครั้งและอุ่น Elution Buffer ไปที่ 55 (เมื่อชิ้นส่วน DNA >3 kb) อาจมีประโยชน์ในการเพิ่มประสิทธิภาพการกู้คืน
โปรแกรมการกู้คืนผลิตภัณฑ์ PCR
โปรโตคอลนี้ใช้ในการทำให้ชิ้นส่วน DNA บริสุทธิ์จากผลิตภัณฑ์ PCR, ระบบปฏิกิริยาของเอนไซม์ และผลิตภัณฑ์ DNA ดิบอื่น ๆ (รวมถึง DNA ทางพันธุกรรม)สารละลายนี้สามารถกำจัดนิวคลีโอไทด์ ไพรเมอร์ ไพรเมอร์ไดเมอร์ โมเลกุลเกลือ เอนไซม์ และสิ่งสกปรกอื่นๆ ได้อย่างมีประสิทธิภาพ
1. ปั่นแยกผลิตภัณฑ์ PCR สารละลายปฏิกิริยาเอนไซม์ และผลิตภัณฑ์น้ำมันดิบ DNA อื่นๆ สั้นๆประมาณปริมาตรด้วยปิเปตและถ่ายโอนไปยังหลอดฆ่าเชื้อขนาด 1.5 มล. หรือ 2 มล.เพิ่ม ddH2O จนกระทั่งปริมาตรสูงถึง 100 μL;ในขณะที่จีโนมดีเอ็นเอที่มีความเข้มข้นสูง การเจือจางถึง 300 ไมโครลิตรด้วย ddH2O จะช่วยปรับปรุงประสิทธิภาพในการฟื้นตัว
2. เติม Buffer GDP จำนวน 5 ปริมาตร ผสมให้เข้ากันโดยการกลับด้านหรือหมุนวนหากส่วน DNA ที่สนใจ >100 bp จำเป็นต้องเติมเอธานอลเพิ่มเติม 1.5 ปริมาตร (ตัวอย่าง + บัฟเฟอร์ GDP)
3. ใส่คอลัมน์กลับเข้าไปในหลอดรวบรวม ย้ายส่วนผสมไปที่คอลัมน์ ปั่นแยกที่ 12,000 รอบต่อนาที (13,800 ×g) เป็นเวลา 30 – 60 วินาทีหากปริมาตรของสารละลายผสม >700 µL ให้ใส่คอลัมน์ดูดซับกลับเข้าไปในหลอดรวบรวม ถ่ายสารละลายที่เหลือไปยังคอลัมน์ดูดซับ และปั่นเหวี่ยงที่ 12,000 รอบต่อนาที (13,800 × g) เป็นเวลา 30 – 60 วินาที
4. ประสิทธิภาพถัดไปอ้างอิงถึงขั้นตอนที่ 5 – 8 ของโปรแกรม 08-1/การสกัดเจล
การใช้งาน
ความเข้มข้นต่างๆ ของเจล TAE หรือ TBE agarose;ผลิตภัณฑ์ PCR ระบบปฏิกิริยาเอนไซม์ หรือผลิตภัณฑ์ DNA ดิบอื่นๆ ที่ได้จากวิธีการต่างๆชิ้นส่วนที่กู้คืนมีตั้งแต่70bp -20 กิโลไบต์
หมายเหตุ
สำหรับใช้ในการวิจัยเท่านั้นไม่ใช้สำหรับขั้นตอนการวินิจฉัย
1. เติมเอธานอล 80 มล. เพื่อเจือจางบัฟเฟอร์ GW ตามที่ระบุไว้บนแท็กก่อนใช้งาน เก็บที่อุณหภูมิห้อง
2. หาก Buffer GDP เกิดการตกตะกอนได้ง่ายระหว่างการเก็บรักษาที่อุณหภูมิต่ำ สามารถวางไว้ที่อุณหภูมิห้องเป็นระยะเวลาหนึ่งก่อนใช้งานหากจำเป็น สามารถอุ่นในอ่างน้ำที่มีอุณหภูมิ 37°C จนกว่าตะกอนจะละลายหมด จากนั้นจึงนำไปใช้หลังการผสมได้
3. ตั้งอุณหภูมิอ่างน้ำไว้ที่ 50 ~55°C ล่วงหน้า
4. ในโปรแกรม 08-1/การสกัดเจลขั้นตอนที่ 1 การลดขนาดของชิ้นเจลจะช่วยลดเวลาในการละลายลงอย่างมาก และเพิ่มประสิทธิภาพในการคืนสภาพ (DNA เชิงเส้นสามารถไฮโดรไลซ์ได้ง่ายเมื่อสัมผัสอย่างต่อเนื่องที่อุณหภูมิสูง)อย่าให้ DNA gel สัมผัสกับรังสียูวีเป็นเวลานาน เนื่องจากแสงอัลตราไวโอเลตอาจทำให้ DNA เสียหายได้
5. ละลายเจลในโปรแกรม 08- 1/เจลสกัดขั้นตอนที่ 2 ให้หมด มิฉะนั้นประสิทธิภาพการฟื้นตัวของ DNA จะได้รับผลกระทบอย่างรุนแรง
6. เปิดฮีท Elution Buffer หรือ ddH2O ไปที่ 55°C ซึ่งมีประโยชน์ในการปรับปรุงประสิทธิภาพการชะล้าง DNAขอแนะนำให้เก็บ DNA ไว้ในตัวชะ Tris-HCl 2.5 mM, pH 7.0 – 8.5
