ชุด EndoFree Plasmid Maxi

สภาพการเก็บรักษา

ควรเก็บ RNaseA ไว้ที่ -30 ~ -15°C และขนส่งที่ ≤0°C

สารกำจัดสารพิษเอนโดท็อกซินสามารถเก็บไว้ที่ 2 ~ 8 ℃ เป็นเวลาหนึ่งเดือน และเก็บไว้ที่ -30 ~ -15 ℃ สำหรับการเก็บรักษาในระยะยาวและขนส่งที่ ≤0℃

ส่วนประกอบอื่นๆ ควรเก็บไว้ที่อุณหภูมิห้อง (15 ~25°C) และขนส่งที่อุณหภูมิห้อง

ส่วนประกอบ

อาร์เนสเอ:10 มก./มล. ใช้เพื่อกำจัด RNA

บัฟเฟอร์ P1:บัฟเฟอร์สารแขวนลอยของแบคทีเรีย เพิ่ม RNaseA ลงในบัฟเฟอร์ P1 ก่อนใช้งานครั้งแรก

บัฟเฟอร์ P2:บัฟเฟอร์สลายแบคทีเรีย (ประกอบด้วย SDS/NaOH)

บัฟเฟอร์ P4:บัฟเฟอร์การทำให้เป็นกลาง

คนเก็บขยะเอนโดท็อกซิน:กำจัดเอนโดทอกซินออกจากสารสกัดพลาสมิดดิบได้อย่างมีประสิทธิภาพ

บัฟเฟอร์ PW:ล้างบัฟเฟอร์ เติมเอทานอลตามปริมาตรที่กำหนดก่อนใช้งานครั้งแรก

บัฟเฟอร์วัณโรค:บัฟเฟอร์ชะล้าง

คอลัมน์ FastPure DNA Maxi:คอลัมน์การดูดซับพลาสมิดดีเอ็นเอ

หลอดคอลเลกชัน 50 มล.:หลอดเก็บกรอง

หลอดเก็บสารเอนโดท็อกซินฟรี:หลอดเก็บพลาสมิดดีเอ็นเอ

วัสดุที่เตรียมไว้

เอทานอลสัมบูรณ์, ไอโซโพรพานอล, หลอดปั่นแยกก้นกลมขนาด 50 มล. และปราศจากเอนโดท็อกซิน 50 มล.หลอดหมุนเหวี่ยง

การใช้งาน

ผลิตภัณฑ์นี้เหมาะสำหรับการสกัดพลาสมิดขนาดใหญ่จากสารละลายแบคทีเรีย 150 - 300 มล.เพาะเลี้ยงข้ามคืน

กระบวนการทดลอง

1. นำสารละลายแบคทีเรีย 150 – 200 มล. (ไม่เกิน 300 มล.) เพาะข้ามคืนแล้วปั่นแยกที่ประมาณ 11,000 รอบต่อนาที (12,000 × g) เป็นเวลา 1 – 2 นาทีทิ้งส่วนเหนือตะกอนและสะสมแบคทีเรีย

Δ เมื่อรวบรวมสารละลายแบคทีเรียมากกว่า 50 มล. สามารถเก็บแบคทีเรียได้โดยการเติมสารละลายแบคทีเรีย ปั่นแยก ทิ้งส่วนเหนือตะกอน และขั้นตอนอื่น ๆ ในหลอดขนาด 50 มล. เดียวกันสำหรับ

หลายครั้ง.

2. เติมบัฟเฟอร์ P1 7.5 มล. (โปรดตรวจสอบว่าได้เพิ่ม RNaseA ลงในบัฟเฟอร์ P1 หรือไม่) ลงในเครื่องปั่นแยกหลอดที่มีแบคทีเรียและผสมให้เข้ากันโดยใช้กระแสน้ำวนหรือการปิเปต

Δ การแขวนลอยของแบคทีเรียโดยสมบูรณ์ในขั้นตอนนี้มีความสำคัญอย่างยิ่งต่อผลผลิต และไม่ควรมีการจับตัวเป็นก้อนของแบคทีเรียหลังจากการแขวนลอยใหม่หากมีก้อนแบคทีเรียผสมกันไม่ทั่วถึงจะส่งผลต่อการสลายทำให้ได้ผลผลิตและความบริสุทธิ์ต่ำหากสารละลายแบคทีเรีย OD600 เท่ากับ 0.65 ขอแนะนำให้ใช้บัฟเฟอร์ P1 7.5 มล. เมื่อสกัดสารละลายแบคทีเรีย 150 มล.เมื่อ OD600 เท่ากับ 0.75 ควรใช้ Buffer P1 8 มล. และควรเปลี่ยนปริมาตรของ Buffer P2 และ P4 ตามลำดับหากปริมาตรของสารละลายแบคทีเรียเพิ่มขึ้นเป็น 200 มล. แนะนำให้ปริมาตรของบัฟเฟอร์ P1, P2 และ P4 จะเพิ่มขึ้นตามสัดส่วน

3. เติม Buffer P2 7.5 มล. ลงในสารแขวนลอยแบคทีเรียจากขั้นตอนที่ 2 และผสมเบาๆ ขึ้นและลงเป็นเวลา 6 – 8ครั้งและฟักที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 4 – 5 นาที

Δ ค่อยๆ พลิกกลับเพื่อผสมให้เข้ากันการทำกระแสน้ำวนจะทำให้เกิดการแตกตัวของ DNA ของจีโนม ส่งผลให้เกิดชิ้นส่วน DNA ของจีโนมในพลาสมิดที่สกัดออกมาในเวลานี้สารละลายจะมีความหนืดและโปร่งแสง แสดงว่าแบคทีเรียถูกสลายจนหมดระยะเวลาไม่ควรเกิน 5 นาทีเพื่อหลีกเลี่ยงการทำลายพลาสมิดหากสารละลายไม่ชัดเจน อาจมีแบคทีเรียมากเกินไปการสลายไม่สมบูรณ์จึงควรลดปริมาณแบคทีเรียให้เหมาะสม

4. เติมบัฟเฟอร์ P4 7.5 มล. ลงในสารแขวนลอยแบคทีเรียจากขั้นตอนที่ 3 แล้วพลิกกลับเบาๆ 6 - 8 ครั้งทันทีเพื่อให้สารละลายทำให้บัฟเฟอร์ P2 เป็นกลางโดยสมบูรณ์ในเวลานี้ควรมีตะกอนตกตะกอนสีขาวปรากฏขึ้นปั่นแยกที่มากกว่าประมาณ 11,000 รอบต่อนาที (12,000 × g) เป็นเวลา 10 – 15 นาที ค่อยๆ ปิเปตส่วนเหนือตะกอนลงในหลอดสำหรับปั่นแยกก้นกลมขนาด 50 มล. ใหม่ (เตรียมเอง) และหลีกเลี่ยงดูดตะกอนสีขาวที่ลอยอยู่

Δ เพิ่มบัฟเฟอร์ P4 แล้วกลับด้านทันทีเพื่อผสมให้เข้ากันปล่อยหลอดทิ้งไว้จนกว่าตะกอนสีขาวจะกระจายเท่าๆ กันทั่วทั้งสารละลาย เพื่อป้องกันการเกิดฝนเฉพาะที่ซึ่งอาจส่งผลต่อการวางตัวเป็นกลางหากไม่มีตะกอนตกตะกอนสีขาวสม่ำเสมอก่อนการปั่นแยกและส่วนเหนือตะกอนไม่ชัดเจนหลังจากการปั่นแยก หลอดสามารถปั่นแยกต่อไปอีก 5 นาที

5. เติมเอนโดท็อกซิน สคาเวนเจอร์ 0. 1 เท่าของปริมาตร (10% ของปริมาตรเหนือตะกอน ประมาณ 2.2 มล.) ของเอนโดท็อกซิน สคาเวนเจอร์ ลงในส่วนเหนือตะกอนจากขั้นตอนที่ 4 แล้วกลับด้านเพื่อผสมวางสารละลายในอ่างน้ำแข็งหรือใส่ลงในน้ำแข็งบด (หรือช่องแช่แข็งในตู้เย็น) เป็นเวลา 5 นาทีจนกระทั่งสารละลายเปลี่ยนจากขุ่นเป็นใสและโปร่งใส (หรือยังคงมีความขุ่นเล็กน้อย) และผสมหลายครั้งเป็นครั้งคราว

Δ หลังจากเติมเอนโดท็อกซิน สคาเวนเจอร์ เข้าไปในส่วนเหนือตะกอน ส่วนเหนือตะกอนจะขุ่น แต่ส่วนลอยเหนือตะกอนควรจะใส (หรือขุ่นเล็กน้อย) หลังจากทำให้เย็นลงในอ่างน้ำแข็ง

6. หลังจากวางส่วนเหนือตะกอนไว้ที่อุณหภูมิห้อง (>25°C) เป็นเวลา 10 – 15 นาที จะขุ่นเนื่องจากอุณหภูมิของมันจะเพิ่มขึ้นถึงอุณหภูมิห้องจากนั้นควรกลับส่วนเหนือตะกอนเพื่อผสม

Δ หากอุณหภูมิห้องต่ำลงหรือคุณต้องการลดเวลาในการสกัด ส่วนเหนือตะกอนสามารถบ่มในอ่างน้ำที่มีอุณหภูมิ 37 ~ 42 ℃ เป็นเวลา 5 – 10 นาที และขั้นตอนต่อไปสามารถดำเนินการได้หลังจากส่วนเหนือตะกอนกลายเป็นขุ่น

7. ปั่นเหวี่ยงส่วนลอยเหนือตะกอนที่ประมาณ 11,000 รอบต่อนาที (12,000 × g) เป็นเวลา 10 นาทีที่อุณหภูมิห้อง (อุณหภูมิต้อง >25°C) เพื่อแยกเฟสเฟสน้ำส่วนบนประกอบด้วย DNA ในขณะที่เฟสน้ำมันสีน้ำเงินชั้นล่างประกอบด้วยเอนโดท็อกซินและสิ่งสกปรกอื่น ๆโอน.ประกอบด้วยดีเอ็นเอที่เป็นน้ำเฟสไปเป็นหลอดใหม่และทิ้งชั้นน้ำมัน

Δ อุณหภูมิระหว่างการหมุนเหวี่ยงจะต้องมากกว่า 25°C เนื่องจากการแยกเฟสที่มีประสิทธิภาพไม่ได้เป็นเช่นนั้นเกิดขึ้นหากอุณหภูมิต่ำเกินไป

Δ หากการแยกเฟสไม่ได้ผล สามารถปรับอุณหภูมิการปั่นแยกเป็น 30°C และสามารถเพิ่มเวลาในการปั่นแยกเป็น 15 นาที

Δ อย่าดูดชั้นมันสีฟ้า เนื่องจากมีเอนโดทอกซินและสิ่งสกปรกอื่นๆ

กลไก

การแขวนลอย Lysis การทำให้เป็นกลางอีกครั้ง

◇ เติมบัฟเฟอร์ P1 7.5 มล

◇ เติมบัฟเฟอร์ P2 7.5 มล

◇ เติมบัฟเฟอร์ P4 7.5 มล

การกำจัดเอนโดท็อกซิน

◇เพิ่ม 0.1 เท่าของปริมาตรเหนือตะกอนของเอนโดท็อกซิน สคาเวนเจอร์

การผูกและการซัก

◇ เพิ่มปริมาตรไอโซโพรพานอล 0.5 เท่า

◇ เติม Buffer PW 10 มล