mRNA Cap2'-O-เมทิลทรานสเฟอเรส

mRNA Cap 2´ -O-methyltransferase มาจากสายพันธุ์รีคอมบิแนนท์ E. coli ที่นำพายีนของวัคซีน mRNA Cap 2 ´-O-Methyltransferaseเอนไซม์นี้เพิ่มกลุ่มเมทิลที่ตำแหน่ง 2'-O ของนิวคลีโอไทด์ตัวแรกที่อยู่ติดกับโครงสร้างหมวกที่ปลาย 5' ของ RNA เอนไซม์ใช้ S-adenosylmethionine (SAM) เป็นตัวบริจาคเมทิลให้กับ RNA ที่ต่อยอดเมทิลเลท (หมวก) -0) ส่งผลให้มีโครงสร้าง cap- 1

โครงสร้าง Cap1 สามารถเพิ่มประสิทธิภาพการแปล โดยปรับปรุงการแสดงออกของ mRNA ในการทดลองการเปลี่ยนถ่ายและการฉีดระดับไมโคร เอนไซม์นี้ต้องการ RNA โดยเฉพาะที่มีฝาปิด m7GpppN เป็นสารตั้งต้นไม่สามารถใช้ RNA กับ pN, ppN, pppN หรือ GpppN ที่จุดสิ้นสุด 5'RNA ที่ปกคลุมอาจถูกเตรียมผ่านการถอดรหัสภายนอกร่างกายโดยใช้แคปแอนะล็อก หรือผ่านการปิดฝาด้วยเอนไซม์โดยใช้ Vaccinia Capping Enzyme

ส่วนประกอบ

mRNA ฝา 2´-O-เมทิลทรานสเฟอเรส (50U/μL)

10×บัฟเฟอร์ปฏิกิริยาสูงสุดที่กำหนด

พื้นที่จัดเก็บ

-25 ～- 15℃ สำหรับการจัดเก็บ （ หลีกเลี่ยงการแช่แข็งและละลายซ้ำหลายครั้ง）

บัฟเฟอร์การจัดเก็บข้อมูล

Tris-HCl 20 mM (pH 8.0，25 ℃), NaCl 100 mM, DTT 1 mM, EDTA 0.1 mM, 0. 1% Triton X- 100， กลีเซอรอล 50%

คำจำกัดความของหน่วย

หนึ่งหน่วยหมายถึงปริมาณของเอนไซม์ที่จำเป็นสำหรับเมทิลเลต 10 พิโมลของทรานสคริปต์ RNA ที่ต่อยอด 80 nt ใน 1 ชั่วโมงที่ 37°C

การทดสอบการควบคุมคุณภาพ

เอ็กโซนิวคลีเอส:50U ของ mRNA Cap 2 ´ -O-Methyltransferase ที่มี 1μg แล-Hind III ย่อย DNA ที่ 37 ℃ เป็นเวลา 16 ชั่วโมง ทำให้ไม่มีการย่อยสลายตามที่กำหนดโดย agarose gel electrophoresis

เอ็นโดนิวคลีเอส: 50 U ของ mRNA Cap 2 ´ -O-Methyltransferase ที่มี 1 μg λDNA ที่ 37°C เป็นเวลา 16 ชั่วโมง จะไม่เกิดการย่อยสลายตามที่กำหนดโดย agarose gel electrophoresis

นิเคส: 50U ของ mRNA Cap 2 ´ -O-Methyltransferase ที่มี 1μg pBR322 ที่ 37 ℃ เป็นเวลา 16 ชั่วโมง ทำให้ไม่มีการย่อยสลายตามที่กำหนดโดย agarose gel electrophoresis

อาร์เนส: 50U ของ mRNA Cap 2 ´ -O-Methyltransferase ที่มี 1.6μg MS2 RNA เป็นเวลา 4 ชั่วโมงที่ 37° ทำให้ไม่มีการย่อยสลายตามที่กำหนดโดย agarose gel electrophoresis

E. โคไล ดีเอ็นเอ: 50U ของ mRNA Cap 2 ´ -O-Methyltransferase ได้รับการคัดกรองว่ามีE. โคไล DNA จีโนมโดยใช้ TaqMan qPCR พร้อมไพรเมอร์เฉพาะสำหรับE. โคไล ตำแหน่ง 16S rRNAที่E. โคไล การปนเปื้อน DNA ของจีโนมคือ =1E. โคไล จีโนม

แบคทีเรีย เอนโดท็อกซิน: การทดสอบ LAL ตาม Chinese Pharmacopoeia IV 2020 ฉบับวิธีทดสอบขีดจำกัดของเจล กฎทั่วไป (1143)ปริมาณเอนโดทอกซินของแบคทีเรียควรเท่ากับ =10 EU/มก.

ระบบปฏิกิริยาและสภาวะ

1. ผสม Capped RNA และ H2O ที่ปราศจาก RNase ในปริมาณที่เหมาะสมในหลอดไมโครฟิวจ์ขนาด 1.5 มล. จนถึงปริมาตรสุดท้ายที่ 16.0 µL

2. อุ่นที่อุณหภูมิ 65°C เป็นเวลา 5 นาที แล้วตามด้วยอ่างน้ำแข็งเป็นเวลา 5 นาที

3. เพิ่มส่วนประกอบต่อไปนี้ตามลำดับที่ระบุ (สำหรับเมทิลเลชั่นของ Capped RNA

น้อยกว่า 10

*10× บัฟเฟอร์ปฏิกิริยาการกำหนดขีดจำกัด : 500 mM Tris-HCl(pH 8.0, 25℃), KCl 50 mM, 10 mM MgCl2 、 10 mM DTT

4. ฟักที่อุณหภูมิ 37°C เป็นเวลา 1 ชั่วโมง (แนะนำให้ฟักตัว 2 ชั่วโมงสำหรับชิ้นส่วนเป้าหมายที่น้อยกว่า 200 nt)

การใช้งาน

เพื่อปรับปรุงการแสดงออกของ mRNA ในระหว่างการทดลองไมโครอินเจ็กชันและการเปลี่ยนถ่าย

หมายเหตุเกี่ยวกับการใช้งาน

1. ก่อนทำปฏิกิริยา ควรทำให้ RNA บริสุทธิ์และละลายในน้ำที่ไม่มีนิวคลีเอส สารละลายทั้งหมดไม่ควรมี EDTA และไอออนใดๆ

2. ขอแนะนำให้อุ่นตัวอย่าง RNA ที่ 65°C เป็นเวลา 5 นาทีก่อนเกิดปฏิกิริยา เพื่อนำโครงสร้างรองที่ปลายด้านที่ 5 ของบันทึกออกสามารถขยายได้ถึง 10 นาทีสำหรับโครงสร้างเทอร์มินัล 5 ' ที่ซับซ้อน