PNGase F
Peptide-N-Glycosidase F(PNGase F) เป็นวิธีเอนไซม์ที่มีประสิทธิภาพสูงสุดในการกำจัดโอลิโกแซ็กคาไรด์ที่เชื่อมโยงกับ N เกือบทั้งหมดออกจากไกลโคโปรตีนPNGase F เป็นอะมิเดสซึ่งแยกระหว่าง GlcNAc ด้านในสุดกับแอสพาราจีนที่ตกค้างของโอลิโกแซ็กคาไรด์ที่มีแมนโนสสูง ลูกผสม และซับซ้อนจากไกลโคโปรตีนที่เชื่อมโยงกับ N
แอปพลิเคชัน
เอนไซม์นี้มีประโยชน์ในการกำจัดคาร์โบไฮเดรตที่ตกค้างออกจากโปรตีน
การเตรียมการและข้อกำหนด
| รูปร่าง | ของเหลวไม่มีสี |
| ความบริสุทธิ์ของโปรตีน | ≥95% (จาก SDS-PAGE) |
| กิจกรรม | ≥500,000 ยูนิต/มิลลิลิตร |
| เอ็กโซไกลโคซิเดส | ไม่พบกิจกรรมใดๆ (ND) |
| เอ็นโดไกลโคซิเดส F1 | ND |
| เอ็นโดไกลโคซิเดส F2 | ND |
| เอนโดไกลโคซิเดส F3 | ND |
| เอ็นโดไกลโคซิเดส H | ND |
| โปรตีเอส | ND |
คุณสมบัติ
| หมายเลขอีซี | 3.5.1.52(รีคอมบิแนนท์จากจุลินทรีย์) |
| น้ำหนักโมเลกุล | 35 กิโลดาลตัน (SDS-PAGE) |
| จุดไอโซอิเล็กทริก | 8. 14 |
| ค่า pH ที่เหมาะสม | 7.0-8.0 |
| อุณหภูมิที่เหมาะสม | 65 องศาเซลเซียส |
| ความจำเพาะของพื้นผิว | การแยกพันธะไกลโคซิดิกระหว่าง GlcNAc และแอสพาราจีนที่ตกค้าง รูปที่ 1 |
| ไซต์การรับรู้ | ไกลแคนที่เชื่อมโยงกับ N เว้นแต่จะมีฟูโคส α1-3 รูปที่ 2 |
| ตัวกระตุ้น | ดีทีที |
| สารยับยั้ง | เอกสารความปลอดภัย |
| อุณหภูมิในการจัดเก็บ | -25 ~-15 ℃ |
| การปิดใช้งานความร้อน | ของผสมปฏิกิริยา 20µL ที่มี PNGase F 1µL ถูกทำให้หมดฤทธิ์โดยการบ่มที่ 75 °C เป็นเวลา 10 นาที |
รูปที่ 1 ความจำเพาะของสารตั้งต้นของ PNGase F
รูปที่ 2 ตำแหน่งการรับรู้ของ PNGase F.
เมื่อสารตกค้าง GlcNAc ภายในเชื่อมโยงกับฟูโคส α1-3 แล้ว PNGase F จะไม่สามารถแยกโอลิโกแซ็กคาไรด์ที่เชื่อมโยงกับ N ออกจากไกลโคโปรตีนได้การปรับเปลี่ยนนี้พบได้ทั่วไปในพืชและไกลโคโปรตีนของแมลงบางชนิด
Cส่วนประกอบ
|
| ส่วนประกอบ | ความเข้มข้น |
| 1 | PNGase F | 50 ไมโครลิตร |
| 2 | 10×บัฟเฟอร์สลายตัวของไกลโคโปรตีน | 1,000 ไมโครลิตร |
| 3 | 10×ไกลโคบัฟเฟอร์ 2 | 1,000 ไมโครลิตร |
| 4 | 10% NP-40 | 1,000 ไมโครลิตร |
คำจำกัดความของหน่วย
หนึ่งหน่วย (U) หมายถึงปริมาณของเอนไซม์ที่ต้องใช้เพื่อกำจัดคาร์โบไฮเดรต >95% ออกจาก RNase B ที่แปลงสภาพ 10 ไมโครกรัมใน 1 ชั่วโมงที่ 37°C ในปริมาตรปฏิกิริยารวม 10 ไมโครลิตร
สภาวะของปฏิกิริยา
1.ละลายไกลโคโปรตีน 1-20 ไมโครกรัมด้วยน้ำปราศจากไอออน เติมบัฟเฟอร์การเสียสภาพของไกลโคโปรตีน 10×ไกลโคโปรตีน 1 ไมโครกรัมและ H2O (หากจำเป็น) เพื่อให้ได้ปริมาตรปฏิกิริยาทั้งหมด 10 ไมโครลิตร
2.ฟักที่อุณหภูมิ 100°C เป็นเวลา 10 นาที นำไปแช่เย็นบนน้ำแข็ง
3.เติม 2 µl 10×GlycoBuffer 2, 2 µl 10% NP-40 แล้วผสม
4.เติม PNGase F และ H 1-2 ไมโครลิตร2O (ถ้าจำเป็น) เพื่อสร้างปริมาตรของปฏิกิริยาทั้งหมด 20 ไมโครลิตรและผสม
5.ปฏิกิริยาฟักตัวที่ 37°C เป็นเวลา 60 นาที
6.สำหรับการวิเคราะห์ SDS-PAGE หรือการวิเคราะห์ HPLC
