ชุด PCR จากโรงงานโดยตรง
หมายเลขแมว: HCR2020A
ชุด Plant Direct PCR เหมาะสำหรับการขยายใบพืช เมล็ดพืช ฯลฯ โดยตรง และสามารถใช้ในการคัดกรองตัวอย่างพืชที่ไม่มีโพลีแซ็กคาไรด์และโพลีฟีนอลด้วยปริมาณงานสูงDNA polymerase ของการขยายโดยตรงตามวิวัฒนาการโดยตรงมีความทนทานต่อสารยับยั้ง PCR ในพืชได้ดีกว่าขณะเดียวกันก็รักษาประสิทธิภาพการขยายสัญญาณสูง ซึ่งเหมาะสำหรับการขยายชิ้นส่วน DNA ภายใน 5 kbสามารถใช้ Lysis buffer A ที่เป็นเอกลักษณ์ในชุดอุปกรณ์ในการแยกเนื้อเยื่อพืชสดหรือแช่แข็งได้ใช้งานง่ายและไลซีนสามารถใช้เป็นเทมเพลตสำหรับการขยายสัญญาณโดยไม่ต้องทำให้บริสุทธิ์ระบบประกอบด้วยสารป้องกันที่ช่วยให้ตัวอย่างน้ำมันดิบสามารถขยายได้อย่างมีประสิทธิภาพหลังจากการแช่แข็งและละลายซ้ำแล้วซ้ำอีก2 × Plant Direct Master Mix ต้องการเพียงเพิ่มไพรเมอร์และเทมเพลตเพื่อทำปฏิกิริยาการขยายสัญญาณ ซึ่งช่วยลดการดำเนินการปิเปตและปรับปรุงปริมาณงานการตรวจจับและความสามารถในการทำซ้ำของผลลัพธ์
ส่วนประกอบ
| ส่วนประกอบ | 50 อาร์เอ็กซ์เอ็นเอส | 200 อาร์เอ็กซ์เอ็นเอส |
| 2 × ส่วนผสมหลักของพืชโดยตรง | 1.25 มล | 4×1.25 มล |
| บัฟเฟอร์ไลซิสจากพืชโดยตรง A | 5 มล | 20 มล |
| บัฟเฟอร์สลายพืชโดยตรง B* | 5 มล | 20 มล |
*Plant Direct Lysis Buffer B เป็นรีเอเจนต์เสริม ซึ่งใช้ในการทำให้ Plant Direct Lysis Buffer A เป็นกลาง เพื่อยืดระยะเวลาการเก็บรักษาตัวอย่างสามารถใช้งานได้ตามสถานการณ์จริง
สภาพการเก็บรักษา
2 × Plant Direct Master Mix เก็บที่ -30 ~ -15 ℃ และหลีกเลี่ยงการแช่แข็งและละลายซ้ำบัฟเฟอร์ Lysis ของพืชโดยตรง เก็บที่ -30 ~ -15 ℃ หรือ 2 ~ 8 ℃
กระบวนการทดลอง
การประมวลผลตัวอย่าง-ใบพืช
วิธีการโดยตรง:ขอแนะนำให้ใช้ใบอ่อนใช้ที่เจาะรูที่มีเส้นผ่านศูนย์กลางคงที่ 0.5 – 3 มม. เพื่อให้ได้ตัวอย่างที่มีขนาดเล็กและสม่ำเสมอ จากนั้นจึงเพิ่มตัวอย่างลงในระบบ PCR โดยตรง (แนะนำให้ใช้ระบบ 50 µl)หมายเหตุ ตรวจสอบให้แน่ใจว่าตัวอย่างอยู่ในสารละลาย PCR และไม่ติดกับผนังท่อหากใช้ PCR โดยตรงเพื่อขยายชิ้นส่วนขนาดยาวและตัวอย่างที่ซับซ้อน การใช้ตัวอย่างที่มีเส้นผ่านศูนย์กลางเล็กกว่า (0.5 – 1 มม.) เป็นเทมเพลตสามารถช่วยให้ได้ผลลัพธ์ที่ดีขึ้น
วิธีการบดสลาย:ขอแนะนำให้ใช้ใบอ่อนนำใบไม้ชิ้นเล็กๆ (เส้นผ่านศูนย์กลางประมาณ 1 – 3 มม.) ใส่ลงใน Plant Direct Lysis Buffer Ab ขนาด 20 μl แล้วบดให้ได้มากที่สุด (ขั้นตอนนี้สามารถทำได้โดยการบีบใบไม้ด้วยปิเปตทิป 100 μl เพื่อบดตัวอย่าง)หากใช้เนื้อเยื่อใบในปริมาณมากขึ้น (ไม่เกิน 7 มม.) ให้เพิ่มปริมาตรของบัฟเฟอร์การเจือจางเป็น 50 ไมโครลิตรหลังจากบดใบแล้ว สารละลายควรปรากฏเป็นสีเขียวหลังจากการปั่นแยกเป็นเวลาสั้นๆ ให้เติมส่วนลอยเหนือตะกอน 1 ไมโครลิตรลงในระบบ PCR เป็นเทมเพลตปฏิกิริยาc
วิธีการสลายความร้อน:ขอแนะนำให้ใช้ใบอ่อนนำใบไม้ชิ้นเล็กๆ (เส้นผ่านศูนย์กลางประมาณ 1 – 3 มม.) ใส่ลงใน Plant Direct Lysis Buffer A ขนาด 20 μl และให้ความร้อนที่ 95°C เป็นเวลา 5 – 10 นาทีสามารถขยายเวลาสลายได้อย่างเหมาะสมสำหรับใบไม้ที่สลายยาก (ไม่เกิน 20 นาที)หากใช้เนื้อเยื่อใบในปริมาณมากขึ้น (ไม่เกิน 7 มม.) ให้เพิ่มปริมาตรของบัฟเฟอร์การเจือจางเป็น 50 ไมโครลิตรหลังจากให้ความร้อนแล้ว ให้หมุนเหวี่ยงเป็นเวลาสั้นๆ และเติมส่วนลอยเหนือตะกอน 1 ไมโครลิตรลงในระบบ PCR เป็นเทมเพลตปฏิกิริยาb
การประมวลผลตัวอย่าง– เมล็ดพันธุ์พืช
วิธีการบดสลาย:ใช้มีดผ่าตัดตัดเมล็ดที่มีเส้นผ่านศูนย์กลาง 5 มม. เพิ่มเมล็ดลงใน Plant Direct Lysis Buffer A 100 ไมโครลิตร แล้วบดตัวอย่างด้วยปิเปตทิปหรือเครื่องมืออื่นๆวอร์เท็กซ์เป็นเวลาสั้นๆ แล้วปล่อยทิ้งไว้ที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 3 – 5 นาทีตรวจสอบให้แน่ใจว่าตัวอย่างเมล็ดแช่อยู่ในบัฟเฟอร์เจือจางหลังจากการปั่นแยกเป็นเวลาสั้นๆ ให้เติมส่วนลอยเหนือตะกอน 1 ไมโครลิตรลงในระบบ PCR เป็นเทมเพลตปฏิกิริยา
วิธีการสลายความร้อน:ใช้มีดผ่าตัดตัดเมล็ดที่มีเส้นผ่านศูนย์กลาง 5 มม. เติมลงใน Plant Direct Lysis Buffer A 100 μl และให้ความร้อนที่ 95°C เป็นเวลา 5 – 10 นาทีสามารถขยายเวลาสลายได้อย่างเหมาะสมสำหรับใบไม้ที่สลายยาก (ไม่เกิน 30 นาที)หลังจากให้ความร้อนแล้ว ให้ปั่นแยกเป็นเวลาสั้นๆ และเติมส่วนลอยเหนือตะกอน 1 ไมโครลิตรให้กับระบบ PCR เป็นเทมเพลตปฏิกิริยาb
ก.สามารถใช้กรรไกรหรือเครื่องมืออื่นๆ เพื่อตัดตัวอย่างที่มีขนาดเหมาะสมได้หากมีการใช้หมัดหรือกรรไกรซ้ำ ควรทำความสะอาดด้วยสารละลายโซเดียมไฮโปคลอไรต์ 2% ก่อนการใช้งานแต่ละครั้งเพื่อป้องกันการปนเปื้อนข้ามระหว่างตัวอย่าง
ข.ตรวจสอบให้แน่ใจว่า Plant Direct Lysis Buffer ละลายจนหมดก่อนใช้งานหากบัฟเฟอร์มีความหนืดหรือตกตะกอน สามารถอุ่นที่อุณหภูมิ 37°C เพื่อให้ละลายหมดก่อนใช้งาน
ค.ปริมาตรของแม่แบบในระบบปฏิกิริยาสามารถปรับได้อย่างเหมาะสมตามความแตกต่างของปริมาตรของวัสดุพืชและสารเจือจางที่เติมเข้าไป
บัฟเฟอร์ไลซิสจากพืชโดยตรง
Plant Direct Lysis Buffer A ที่มีอยู่ในผลิตภัณฑ์นี้ได้รับการปรับปรุงอย่างเข้มงวดเพื่อปลดปล่อยจีโนมของเนื้อเยื่อพืชส่วนใหญ่ และเหมาะสำหรับการเก็บรักษาพืชดิบในระยะสั้นที่อุณหภูมิ 4°Cหากจำเป็นต้องจัดเก็บตัวอย่างเป็นระยะเวลานานขึ้น (เช่น 1 – 2 เดือน) แนะนำให้ย้ายส่วนลอยเหนือตะกอนไปยังหลอด EP ใหม่และเก็บไว้ที่ -20°Cหากต้องการเก็บตัวอย่างให้เสถียรยิ่งขึ้น ให้เติม Plant Direct Lysis Buffer B ในปริมาตรที่เท่ากันลงในส่วนลอยเหนือตะกอนที่ถ่ายโอน ผสมให้เข้ากัน และเก็บที่อุณหภูมิ -20°Cระยะเวลาการเก็บรักษาที่มั่นคงจะแตกต่างกันไปตามตัวอย่างพืชและสถานะของพืช
ระบบปฏิกิริยา
| ddH2O | ถึง 20.0 ไมโครลิตร | ถึง 50.0 ไมโครลิตร |
| 2 × ส่วนผสมหลักของพืชโดยตรงa | 10.0 ไมโครลิตร | 25.0 ไมโคร |
| ไพรเมอร์ 1 (10 µM) | 0.8 ไมโครลิตร | 2.0 ไมโครลิตร |
| ไพรเมอร์ 2 (10 µM)b | 0.8 ไมโครลิตร | 2.0 ไมโครลิตร |
| ตัวอย่างสารสกัดจากใบพืช/สารสกัดจากดิบ(อ้างอิงถึงการประมวลผลตัวอย่าง) | แผ่นใบ 0.5 – 3 มม./x µl | แผ่นใบ 0.5 – 3 มม./x µl |
ก.ประกอบด้วยมก2+ที่ความเข้มข้นสุดท้ายที่ 2 mM
ข.ขอแนะนำให้ใช้ความเข้มข้นสุดท้ายที่ 0.4μM สำหรับไพรเมอร์แต่ละตัวการใช้ไพรเมอร์มากเกินไปจะนำไปสู่การขยายสัญญาณที่ไม่เฉพาะเจาะจงเพิ่มขึ้น
ค.สามารถปรับปริมาณตัวอย่างที่ใช้ได้ตามสถานการณ์จริงปริมาณที่ใช้ในปฏิกิริยาเดี่ยวของตัวอย่าง lysed ที่เป็นน้ำมันดิบสามารถปรับได้ระหว่าง 2% - 20% ของปริมาตรทั้งหมดของปฏิกิริยาการใช้ตัวอย่างมากเกินไปอาจทำให้แอมพลิฟายเออร์ล้มเหลวได้
โปรแกรมปฏิกิริยา
| ขั้นตอน | อุณหภูมิ | เวลา |
| การเสียสภาพเริ่มต้น | 98 ℃ | 5 นาที |
| การเสียสภาพ | 95 ℃ | 10 วินาที |
| การหลอม | 58 ~ 72 ℃ | 15 วินาที |
| ส่วนขยาย | 72 ℃ | 30 วินาที |
| ส่วนขยายสุดท้าย | 72 ℃ | 5 นาที |
ก.การสูญเสียสภาพธรรมชาติเริ่มต้น (98°C, 5 นาที) ส่งเสริมการสลายของเนื้อเยื่อพืช โดยปล่อย DNA ของจีโนมที่สามารถนำไปใช้ในการขยาย PCR ได้อย่าย่นระยะเวลาหรือลดอุณหภูมิ
ข.ขอแนะนำให้ตั้งค่าให้เท่ากับค่าไพรเมอร์ Tm หรือสูงกว่าค่า Tm 2 ~ 4°CDNA polymerase การขยายโดยตรงที่ใช้ในผลิตภัณฑ์นี้แตกต่างจาก Taq DNA polymerase ทั่วไป และมีข้อกำหนดพิเศษสำหรับอุณหภูมิการหลอมปฏิกิริยา การใช้อุณหภูมิการหลอมสูงสามารถลดการขยายที่ไม่เฉพาะเจาะจงได้อย่างมีประสิทธิภาพและปรับปรุงประสิทธิภาพการขยายสำหรับเทมเพลตที่ซับซ้อน การขยายสัญญาณที่มีประสิทธิภาพสามารถทำได้โดยการปรับอุณหภูมิการหลอมและยืดเวลาการขยายออกไป
ค.หากความยาวของผลิตภัณฑ์แอมพลิฟายเออร์คือ ≤1 kb เวลาในการขยายจะถูกตั้งค่าไว้ที่ 30 วินาที/kb;หากความยาวของผลิตภัณฑ์ขยายเสียงคือ >1 kb เวลาขยายจะถูกตั้งไว้ที่ 60 วินาที/kb
ง.สำหรับตัวอย่างที่ซับซ้อนหรือตัวอย่างที่มีอัตราการขยายต่ำ สามารถเพิ่มจำนวนรอบได้อย่างเหมาะสมเป็น 40 -50 รอบ
การใช้งาน
ใช้ได้กับการขยายเนื้อเยื่อพืชโดยตรงและการคัดกรองตัวอย่างพืชที่ไม่มีโพลีแซ็กคาไรด์และโพลีฟีนอลในปริมาณสูง
หมายเหตุ
สำหรับใช้ในการวิจัยเท่านั้นไม่ใช้สำหรับขั้นตอนการวินิจฉัย
1. สำหรับการขยายพันธุ์พืชดิบหรือการขยายโดยตรง ขอแนะนำให้ใช้ DNA จีโนมบริสุทธิ์เป็นตัวควบคุมเชิงบวกก่อนเริ่มการทดลองเพื่อให้แน่ใจว่าระบบ ไพรเมอร์ และการปฏิบัติงานถูกต้อง
2. DNA polymerase ขยายโดยตรงที่ใช้ในชุดอุปกรณ์นี้มีกิจกรรมการพิสูจน์อักษรที่แข็งแกร่งหากจำเป็นต้องทำการโคลน TA แนะนำให้ทำให้ DNA บริสุทธิ์ก่อนเติมอะดีนีน
3. คำแนะนำในการออกแบบสีรองพื้น：
ก.ขอแนะนำว่าฐานสุดท้ายที่ปลาย 3′ ของไพรเมอร์ควรเป็น G หรือ C
ข.ควรหลีกเลี่ยงการไม่ตรงกันติดต่อกันใน 8 ฐานสุดท้ายที่ปลาย 3′ ของไพรเมอร์ค.หลีกเลี่ยงโครงสร้างกิ๊บที่ปลาย 3′ ของไพรเมอร์
ง.ความแตกต่างของค่า Tm ของไพรเมอร์แบบฟอร์เวิร์ดและไพรเมอร์แบบย้อนกลับไม่ควรเกิน 1°C และค่า Tm ควรปรับเป็น 60 ~ 72°C (แนะนำให้ใช้ Primer Premier 5 เพื่อคำนวณค่า Tm)
จ.ไม่ควรรวมลำดับไพรเมอร์เพิ่มเติมที่ไม่ตรงกับเทมเพลตเมื่อคำนวณค่าไพรเมอร์ Tm
ฉ.ขอแนะนำให้เนื้อหา GC ของไพรเมอร์เป็น 40% -60%
ก.การกระจายตัวโดยรวมของ A, G, C และ T ในไพรเมอร์ควรมีความสม่ำเสมอมากที่สุดหลีกเลี่ยงการใช้ภูมิภาคที่มีเนื้อหา GC หรือ AT สูง
ชม.หลีกเลี่ยงการมีลำดับเสริมตั้งแต่ 5 เบสขึ้นไป ไม่ว่าจะอยู่ภายในไพรเมอร์หรือระหว่างไพรเมอร์สองตัว และหลีกเลี่ยงการมีลำดับเสริมตั้งแต่ 3 เบสขึ้นไปที่ปลาย 3′ ของไพรเมอร์สองตัว
ฉัน.ใช้ฟังก์ชัน NCBI BLAST เพื่อตรวจสอบความจำเพาะของไพรเมอร์ เพื่อป้องกันการขยายแบบไม่เฉพาะเจาะจง
