เอนไซม์ปิดฝาไวรัสวัคซีน

เอนไซม์ปิดฝาไวรัส Vaccinia ได้มาจากสายพันธุ์รีคอมบิแนนท์ E. coli ซึ่งมียีนสำหรับเอนไซม์ปิดฝา Vacciniaเอนไซม์เดี่ยวนี้ประกอบด้วยสองหน่วยย่อย (D1 และ D12) และมีฤทธิ์ของเอนไซม์สามอย่าง (RNA triphosphatase และ guanylyltransferase โดยหน่วยย่อย D1 และ guanine methyltransferase โดยหน่วยย่อย D12)Vaccinia virus Capping Enzyme มีประสิทธิภาพในการเร่งการก่อตัวของโครงสร้างหมวก ซึ่งสามารถแนบโครงสร้างหมวก 7-methylguanylate (m7Gppp, Cap 0) เข้ากับปลาย 5′ ของ RNA ได้โดยเฉพาะโครงสร้างแคป (แคป 0) มีบทบาทสำคัญในการรักษาเสถียรภาพของ mRNA การขนส่ง และการแปลในยูคาริโอตการจำกัด RNA ด้วยปฏิกิริยาของเอนไซม์เป็นวิธีการที่มีประสิทธิภาพและง่ายดาย ซึ่งสามารถปรับปรุงเสถียรภาพและการแปล RNA สำหรับการถอดรหัส การถ่ายเซลล์ และการฉีดขนาดจิ๋ว ในหลอดทดลอง ได้อย่างมีนัยสำคัญ

ส่วนประกอบ

เอนไซม์ปิดฝาไวรัสวัคซีน (10 U/μL)

10×บัฟเฟอร์สูงสุดที่กำหนด

สภาพการเก็บรักษา

-25~- 15℃ สำหรับการจัดเก็บ （ หลีกเลี่ยงการแช่แข็งและละลายซ้ำหลายครั้ง）

บัฟเฟอร์การจัดเก็บข้อมูล

ทริส-HCl 20 มิลลิโมลาร์ (pH 8.0), NaCl 100 มิลลิโมลาร์,

1mM DTT, 0.1mM EDTA, 0.1% ไทรทัน X- 100, กลีเซอรอล 50%

คำจำกัดความของหน่วย

เอนไซม์ปิดฝาไวรัส Vaccinia หนึ่งหน่วยหมายถึงปริมาณของเอนไซม์ที่จำเป็นในการรวม 10pmol ของ GTP ลงในบันทึก 80nt ใน 1 ชั่วโมงที่อุณหภูมิ 37°C

ควบคุมคุณภาพ

เอ็กโซนิวคลีเอส:10U ของ Vaccinia virus Capping Enzyme ที่มี 1μg แล-Hind III ย่อย DNA ที่ 37 ℃ เป็นเวลา 16 ชั่วโมง ทำให้ไม่มีการย่อยสลายตามที่กำหนดโดย agarose gel electrophoresis

เอ็นโดนิวคลีเอส:10U ของ Vaccinia virus Capping Enzyme ด้วย 1μg แลมดีเอ็นเอ ที่ 37°C เป็นเวลา 16 ชั่วโมง จะไม่เกิดการย่อยสลายตามที่กำหนดโดย agarose gel electrophoresis

นิเคส:10U ของ Vaccinia virus Capping Enzyme ด้วย 1 μg pBR322 ที่ 37 ℃ เป็นเวลา 16 ชั่วโมง ทำให้ไม่มีการย่อยสลายตามที่กำหนดโดย agarose gel electrophoresis

อาร์เนส:เอนไซม์สำหรับปิดไวรัส Vaccinia ขนาด 10U ที่มี MS2 RNA 1.6μg เป็นเวลา 4 ชั่วโมงที่ 37°C จะไม่เกิดการย่อยสลายตามที่กำหนดโดย agarose gel electrophoresis

1.โคไลดีเอ็นเอ:เอนไซม์ปิดฝาไวรัส Vaccinia ขนาด 10U ได้รับการคัดกรองเพื่อดูการมีอยู่ของ DNA จีโนมของ E. coli โดยใช้ TaqMan qPCR พร้อมไพรเมอร์เฉพาะสำหรับตำแหน่ง E. coli 16S rRNAการปนเปื้อนของดีเอ็นเอของจีโนมของ E. coli มีค่าน้อยกว่า 1 จีโนมของ E. coli

2.แบคทีเรีย เอนโดท็อกซิน: การทดสอบ LAL ตาม Chinese Pharmacopoeia IV 2020 ฉบับวิธีทดสอบขีดจำกัดของเจล กฎทั่วไป (1143)ปริมาณเอนโดทอกซินของแบคทีเรียควรอยู่ที่ ≤10 EU/มก.

ระบบปฏิกิริยาและสภาวะ

1. เกณฑ์วิธีสูงสุดที่กำหนด (ปริมาตรปฏิกิริยา: 20 ไมโครลิตร)

ขั้นตอนนี้ใช้ได้กับปฏิกิริยาการกำหนดสูงสุดของ 10μg RNA (≥100 nt) และสามารถขยายขนาดได้ตามความต้องการในการทดลอง

I) รวม 10μg RNA และ H2O ที่ปราศจากนิวคลีเอสในหลอดไมโครฟิวจ์ขนาด 1.5 มล. ให้เป็นปริมาตรสุดท้ายที่ 15.0 µL*10×บัฟเฟอร์การกำหนด: 0.5M Tris-HCl, KCl 50 มม., MgCl2 10 มม., DTT 10 มม., (25°C, pH 8.0)

2) อุ่นที่อุณหภูมิ 65°C เป็นเวลา 5 นาที แล้วตามด้วยอ่างน้ำแข็งเป็นเวลา 5 นาที

3) เพิ่มส่วนประกอบต่อไปนี้ตามลำดับที่ระบุ

*10×บัฟเฟอร์การจำกัด：0.5 M Tris-HCl, KCl 50 mM, MgCl2 10 mM, DTT 10 mM, (25℃, pH8.0)

4) ฟักตัวที่ 37°C เป็นเวลา 30 นาที ขณะนี้ RNA ถูกปิดและพร้อมสำหรับการใช้งานขั้นปลายน้ำ

2. เทอร์มินัล 5 ฟุต ปฏิกิริยาการติดฉลาก (ปริมาตรของปฏิกิริยา: 20 ไมโครลิตร)

โปรโตคอลนี้ออกแบบมาเพื่อติดฉลาก RNA ที่มีไตรฟอสเฟตขนาด 5′ และสามารถขยายขนาดได้ตามความต้องการประสิทธิภาพของการรวมฉลากจะได้รับผลกระทบจากอัตราส่วนโมลาร์ของ RNA: GTP รวมถึงเนื้อหา GTP ในตัวอย่าง RNA

1) ผสม RNA และ H2O ปลอดนิวคลีเอสในปริมาณที่เหมาะสมในหลอดไมโครฟิวจ์ขนาด 1.5 มล. จนได้ปริมาตรสุดท้ายคือ 14.0 µL

2) อุ่นที่อุณหภูมิ 65°C เป็นเวลา 5 นาที แล้วตามด้วยอ่างน้ำแข็งเป็นเวลา 5 นาที

3) เพิ่มส่วนประกอบต่อไปนี้ตามลำดับที่ระบุ

** GTP MIX หมายถึง GTP และเครื่องหมายจำนวนเล็กน้อยสำหรับความเข้มข้นของ GTP โปรดดูที่ถึงหมายเหตุ 3

4) ฟักที่อุณหภูมิ 37°C เป็นเวลา 30 นาที ปลาย RNA 5′ มีป้ายกำกับและพร้อมสำหรับล่อง

การใช้งาน

1. การกำหนด mRNA ก่อนการวิเคราะห์การแปล/การแปลในหลอดทดลอง

2. การติดฉลาก 5′ สิ้นสุดของ mRNA

หมายเหตุเกี่ยวกับการใช้งาน

1.การทำความร้อนสารละลาย RNA ก่อนที่จะฟักตัวด้วย Vaccinia Capping Enzyme จะขจัดโครงสร้างทุติยภูมิที่ส่วนท้ายที่ 5 ของบันทึกขยายเวลาเป็น 60 นาทีสำหรับการถอดเสียงโดยมีส่วนปลาย 5' ที่มีโครงสร้างสูง

2. RNA ที่ใช้สำหรับปฏิกิริยาปิดฝาควรได้รับการทำให้บริสุทธิ์ก่อนใช้งานและแขวนลอยในน้ำที่ปราศจากนิวคลีเอสไม่ควรมี EDTA และสารละลายควรปราศจากเกลือ

3. สำหรับการติดฉลากที่ปลาย 5′ ความเข้มข้นของ GTP ทั้งหมดควรอยู่ที่ประมาณ 1-3 เท่าของความเข้มข้นของ mRNA ในปฏิกิริยา

4. ปริมาตรของระบบปฏิกิริยาสามารถปรับขนาดขึ้นหรือลงได้ตามความเป็นจริง