M-MLV Neoscript Reverse Transcriptase
Neoscript Reverse Transcriptase เป็น Reverse Transcriptase ที่ได้จากการตรวจคัดกรองการกลายพันธุ์ของยีน M-MLV ของต้นกำเนิดและการแสดงออกของไวรัสมะเร็งเม็ดเลือดขาว Moloney murine ใน E.coliเอนไซม์จะกำจัดกิจกรรมของ RNase H มีความทนทานต่ออุณหภูมิที่สูงกว่า และเหมาะสำหรับการถอดรหัสแบบย้อนกลับที่อุณหภูมิสูงดังนั้นจึงมีประโยชน์ในการขจัดผลกระทบที่ไม่พึงประสงค์ของโครงสร้างระดับสูงของ RNA และปัจจัยที่ไม่เฉพาะเจาะจงต่อการสังเคราะห์ cDNA และมีเสถียรภาพที่สูงขึ้นและความสามารถในการสังเคราะห์การถอดรหัสแบบย้อนกลับเอนไซม์มีเสถียรภาพสูงกว่าและมีความสามารถในการสังเคราะห์การถอดรหัสแบบย้อนกลับ
ส่วนประกอบ
1.200 U/μL Neoscript Reverse Transcriptase
2.5 ×บัฟเฟอร์เส้นแรก (อุปกรณ์เสริม)
* 5 × First-Strand Buffer ไม่มี dNTP โปรดเพิ่ม dNTP เมื่อเตรียมระบบปฏิกิริยา
แอปพลิเคชั่นที่แนะนำ
1.qRT-PCR ในขั้นตอนเดียว
2.การตรวจหาไวรัส RNA
สภาพการเก็บรักษา
-20°C สำหรับการเก็บรักษาในระยะยาว ควรผสมให้เข้ากันก่อนใช้งาน หลีกเลี่ยงการแช่แข็งและละลายบ่อยๆ
คำจำกัดความของหน่วย
หนึ่งหน่วยรวม dTTP 1 นาโนโมลใน 10 นาทีที่อุณหภูมิ 37°C โดยใช้โพลี(A)•โอลิโก(dT)25เป็นเทมเพลต/ไพรเมอร์
ควบคุมคุณภาพ
1.ความบริสุทธิ์ของอิเล็กโตรโฟเรติก SDS-PAGE มากกว่า 98%
2.ความไวในการขยาย การควบคุมแบบแบตช์ต่อแบตช์ ความเสถียร
3.ไม่มีกิจกรรมของนิวคลีเอสจากภายนอก ไม่มีการปนเปื้อนของเอนโดนิวคลีเอสหรือเอ็กโซนิวคลีเอสจากภายนอก
การตั้งค่าปฏิกิริยาสำหรับโซลูชันปฏิกิริยาลูกโซ่ครั้งแรก
1.การเตรียมส่วนผสมของปฏิกิริยา
| ส่วนประกอบ | ปริมาณ |
| โอลิโก(dT)12-18 ไพรเมอร์ หรือไพรเมอร์แบบสุ่มก หรือไพรเมอร์เฉพาะยีนb | 50 น |
| 50 โมงเช้า (20-100 โมงเย็น) | |
| 14.00 น | |
| 10 มิลลิโมลาร์ dNTP | 1 ไมโครลิตร |
| เทมเพลต RNA | รวมRNA≤5μg;mRNA≤ 1 ไมโครกรัม |
| dH ปราศจาก RNase2O | ถึง 10 ไมโครลิตร |
หมายเหตุ:a/b: โปรดเลือกไพรเมอร์ประเภทต่างๆ ตามความต้องการในการทดลองของคุณ
2.ความร้อนที่ 65°C เป็นเวลา 5 นาที และเย็นอย่างรวดเร็วบนน้ำแข็งเป็นเวลา 2 นาที
3.เพิ่มส่วนประกอบต่อไปนี้ลงในระบบข้างต้นให้มีปริมาตรรวม 20µL และผสมเบาๆ:
| ส่วนประกอบ | ปริมาณ (ไมโครลิตร) |
| 5 ×บัฟเฟอร์สาระแรก | 4 |
| Neoscript Reverse Transcriptase (200 U / μL) | 1 |
| สารยับยั้ง RNase (40 U/μL) | 1 |
| dH ปราศจาก RNase2O | ถึง 20 ไมโครลิตร |
4.โปรดทำปฏิกิริยาตามเงื่อนไขต่อไปนี้:
(1) หากใช้ Random Primer ควรทำปฏิกิริยาที่อุณหภูมิ 25°C เป็นเวลา 10 นาที และที่ 50°C เป็นเวลา 30~60 นาที
(2) หากใช้ Oligo dT หรือไพรเมอร์เฉพาะ ควรทำปฏิกิริยาที่อุณหภูมิ 50°C เป็นเวลา 30~60 นาที
5.ให้ความร้อนที่ 95°C เป็นเวลา 5 นาทีเพื่อหยุดการทำงานของ Neoscript Reverse Transcriptase และยุติปฏิกิริยา
6.ผลิตภัณฑ์การถอดรหัสแบบย้อนกลับสามารถนำมาใช้โดยตรงในปฏิกิริยา PCR และปฏิกิริยา PCR เชิงปริมาณเรืองแสง หรือเก็บไว้ที่ -20°C เป็นเวลานาน
พีซีอาร์ อาร์การกระทำ：
1.การเตรียมส่วนผสมของปฏิกิริยา
| ส่วนประกอบ | ความเข้มข้น |
| บัฟเฟอร์ PCR 10 × (ไม่มี dNTP, ไม่มี Mg²+) | 1× |
| dNTP (10mM ต่อ dNTP) | 200 ไมโครโมลาร์ |
| MgCl 25 มิลลิโมลาร์2 | 1-4 มม |
| Taq DNA โพลีเมอเรส (5U/μL) | 2-2.5 ยู |
| ไพรเมอร์ 1 (10 ไมโครโมลาร์) | 0.2-1 ไมโครโมลาร์ |
| ไพรเมอร์ 2 (10 ไมโครโมลาร์) | 0.2-1 ไมโครโมลาร์ |
| แม่แบบก | สารละลายปฏิกิริยาลูกโซ่แรก ≤10% (2 ไมโครลิตร) |
| ddH2O | ถึง 50 ไมโครลิตร |
หมายเหตุ:ตอบ: หากเติมสารละลายปฏิกิริยาลูกโซ่แรกมากเกินไป ปฏิกิริยา PCR อาจถูกยับยั้ง
2.ขั้นตอนปฏิกิริยา PCR
| ขั้นตอน | อุณหภูมิ | เวลา | รอบ |
| การเสียสภาพก่อนกำหนด | 95 ℃ | 2-5 นาที | 1 |
| การเสียสภาพ | 95 ℃ | 10-20 วินาที | 30-40 |
| การหลอม | 50-60 ℃ | 10-30 วินาที | |
| ส่วนขยาย | 72 ℃ | 10-60 วินาที |
หมายเหตุ
1.เหมาะสำหรับการเพิ่มประสิทธิภาพอุณหภูมิการถอดรหัสแบบย้อนกลับในช่วง 42°C~55°C
2.มีเสถียรภาพที่ดีกว่า เหมาะสำหรับการขยายการถอดรหัสแบบย้อนกลับที่อุณหภูมิสูงนอกจากนี้ยังเป็นผลดีต่อการส่งผ่านบริเวณโครงสร้างที่ซับซ้อนของ RNA ได้อย่างมีประสิทธิภาพอีกด้วยเหมาะสำหรับการตรวจจับ RT-PCR เชิงปริมาณมัลติเพล็กซ์เรืองแสงในขั้นตอนเดียว
3.เข้ากันได้ดีกับเอนไซม์ขยาย PCR ต่างๆ และเหมาะสำหรับปฏิกิริยา RT-PCR ที่มีความไวสูง
4.เหมาะสำหรับปฏิกิริยา RT-PCR เชิงปริมาณเรืองแสงขั้นตอนเดียวที่มีความไวสูง ปรับปรุงอัตราการตรวจจับของเทมเพลตที่มีความเข้มข้นต่ำได้อย่างมีประสิทธิภาพ
5.เหมาะสำหรับการสร้างห้องสมุด cDNA
