โปรตีน K mNGS (ของเหลว)
โปรตีเอส K เป็นซีรีนโปรตีเอสที่เสถียรและมีความจำเพาะของสารตั้งต้นในวงกว้างมันย่อยสลายโปรตีนหลายชนิดในสภาพดั้งเดิมแม้ในที่ที่มีผงซักฟอกก็ตามหลักฐานจากการศึกษาโครงสร้างผลึกและโมเลกุลบ่งชี้ว่าเอนไซม์อยู่ในตระกูลซับติลิซินซึ่งมีตัวเร่งปฏิกิริยาสามตำแหน่งที่ทำงานอยู่ (Asp39-ของเขา69-เซอร์224-ตำแหน่งเด่นของความแตกแยกคือพันธะเปปไทด์ที่อยู่ติดกับหมู่คาร์บอกซิลของกรดอะมิโนอะลิฟาติกและอะโรมาติกที่มีหมู่อัลฟาอะมิโนที่ถูกบล็อกมักใช้เพื่อความเฉพาะเจาะจงในวงกว้างโปรตีเอสเคนี้ได้รับการออกแบบมาเป็นพิเศษสำหรับ mNGSเมื่อเปรียบเทียบกับโปรตีเอส K อื่นๆ มีการปนเปื้อนของกรดนิวคลีอิกน้อยกว่าด้วยซ้ำด้วยประสิทธิภาพของเอนไซม์ที่เท่ากัน ซึ่งสามารถรับประกันการใช้งาน mNGS ดาวน์สตรีมได้ดีขึ้น
สภาพการเก็บรักษา
2-8 ℃เป็นเวลา 2 ปี
ข้อมูลจำเพาะ
| รูปร่าง | ของเหลวไม่มีสีถึงสีน้ำตาลอ่อน |
| กิจกรรม | ≥800ยู/มล |
| ความเข้มข้นของโปรตีน | ≥20 มก./มล |
| นิเคส | ไม่พบสิ่งใดเลย |
| ดีเนส | ไม่พบสิ่งใดเลย |
| อาร์เนส | ไม่พบสิ่งใดเลย |
คุณสมบัติ
| หมายเลขอีซี | 3.4.21.64(รีคอมบิแนนท์จากอัลบั้มไตรติราเชียม) |
| จุดไอโซอิเล็กทริก | 7.81 |
| ค่า pH ที่เหมาะสม | 7.0- 12.0 รูปที่ 1 |
| อุณหภูมิที่เหมาะสม | 65 ℃ รูปที่ 2 |
| ความคงตัวของค่า pH | pH 4.5- 12.5 (25 ℃, 16 ชม.) รูปที่ 3 |
| เสถียรภาพทางความร้อน | ต่ำกว่า 50 ℃ (pH 8.0, 30 นาที) รูปที่ 4 |
| ความเสถียรในการจัดเก็บ | กิจกรรมมากกว่า 90% เป็นเวลา 12 เดือนที่ 25 ℃ |
| ตัวกระตุ้น | SDS, ยูเรีย |
| สารยับยั้ง | ไดไอโซโพรพิลฟลูออโรฟอสเฟต;ฟีนิลเมทิลซัลโฟนิลฟลูออไรด์ |
การใช้งาน
1. ชุดตรวจวินิจฉัยทางพันธุกรรม
2. ชุดสกัด RNA และ DNA
3. การสกัดส่วนประกอบที่ไม่ใช่โปรตีนออกจากเนื้อเยื่อ การย่อยสลายสิ่งเจือปนของโปรตีน เช่น DNAวัคซีนและการเตรียมเฮปาริน
4. การเตรียมโครโมโซม DNA โดยวิธีพัลซ์อิเล็กโตรโฟรีซิส
5. รอยเปื้อนแบบตะวันตก
6. รีเอเจนต์อัลบูมินของเอนไซม์ไกลโคซิเลต ในการวินิจฉัยภายนอกร่างกาย
ข้อควรระวัง
สวมถุงมือและแว่นตาป้องกันเมื่อใช้หรือชั่งน้ำหนัก และจัดให้มีการระบายอากาศที่ดีหลังการใช้งานผลิตภัณฑ์นี้อาจก่อให้เกิดอาการแพ้ทางผิวหนังและการระคายเคืองต่อดวงตาอย่างรุนแรงหากสูดดมเข้าไปอาจทำให้เกิดอาการภูมิแพ้ หอบหืด หรือหายใจลำบากได้อาจระคายเคืองต่อทางเดินหายใจ.
คำจำกัดความของหน่วย
หนึ่งหน่วย (U) หมายถึงปริมาณของเอนไซม์ที่จำเป็นในการไฮโดรไลซ์เคซีนเพื่อผลิต 1 ไมโครโมลไทโรซีนต่อนาทีภายใต้เงื่อนไขต่อไปนี้
การเตรียมรีเอเจนต์
รีเอเจนต์ I: เคซีนนม 1 กรัมละลายในสารละลายโซเดียมฟอสเฟต 0.1 โมลาร์ 50 มล. (pH 8.0) บ่มในน้ำ 65-70 ℃ เป็นเวลา 15 นาที กวนและละลาย ระบายความร้อนด้วยน้ำ ปรับด้วยโซเดียมไฮดรอกไซด์เป็น pH 8.0 และปริมาตรคงที่ 100มล.
รีเอเจนต์ II: กรดไตรคลอโรอะซิติก 0.1 โมลาร์, โซเดียมอะซิเตต 0.2 โมลาร์, กรดอะซิติก 0.3 โมลาร์
รีเอเจนต์ III: 0.4M Na2CO3สารละลาย.
รีเอเจนต์ IV: รีเอเจนต์ Forint เจือจางด้วยน้ำบริสุทธิ์ 5 ครั้ง
รีเอเจนต์ V: สารเจือจางของเอนไซม์: สารละลายโซเดียมฟอสเฟต 0.1 โมลาร์ (pH 8.0)
รีเอเจนต์ VI: สารละลายไทโรซีน: 0, 0.005, 0.025, 0.05, 0.075, 0.1, 0.25 ไมโครโมล/มล. ไทโรซีนละลายด้วย 0.2เอ็ม เอชซีแอล
ขั้นตอน
1. รีเอเจนต์ I 0.5 มล. อุ่นไว้ล่วงหน้าที่อุณหภูมิ 37°C เติมสารละลายเอนไซม์ 0.5 มล. ผสมให้เข้ากัน และบ่มที่37°C เป็นเวลา 10 นาที
2. เติมรีเอเจนต์ II 1 มล. เพื่อหยุดปฏิกิริยา ผสมให้เข้ากัน และฟักตัวต่อไปอีก 30 นาที
3. สารละลายปฏิกิริยาหมุนเหวี่ยง
4. ใช้ส่วนลอยเหนือตะกอน 0.5 มล. เติมรีเอเจนต์ III 2.5 มล., รีเอเจนต์ IV 0.5 มล. ผสมให้เข้ากันและฟักที่อุณหภูมิ 37 ℃เป็นเวลา 30 นาที
5. โอดี660ถูกกำหนดให้เป็น OD1-กลุ่มควบคุมเปล่า: ใช้รีเอเจนต์ V 0.5 มล. เพื่อทดแทนเอนไซม์สารละลายเพื่อกำหนด OD660เป็น OD2, ∆OD=OD1-OD2.
6. เส้นโค้งมาตรฐานของ L-ไทโรซีน: สารละลาย L-ไทโรซีนที่มีความเข้มข้นต่างกัน 0.5 มล., รีเอเจนต์ III 2.5 มล., รีเอเจนต์ IV 0.5 มล. ในหลอดหมุนเหวี่ยงขนาด 5 มล. บ่มใน 37°C เป็นเวลา 30 นาที ตรวจหา OD660สำหรับความเข้มข้นที่แตกต่างกันของ L-ไทโรซีน จากนั้นจะได้เส้นโค้งมาตรฐาน Y=kX+b โดยที่ Y คือความเข้มข้นของ L-ไทโรซีน X คือ OD600.
การคำนวณ
2: ปริมาตรรวมของสารละลายปฏิกิริยา (มล.)
0.5: ปริมาตรของสารละลายเอนไซม์ (มล.)
0.5: ปริมาตรของเหลวของปฏิกิริยาที่ใช้ในการกำหนดปริมาณโครโมเจนิก (มล.)
10: เวลาปฏิกิริยา (นาที)
Df: เจือจางหลายเท่า
C: ความเข้มข้นของเอนไซม์ (มก./มล.)
อ้างอิง
1. Wieger U และ Hilz H. FEBS Lett(1972);23:77.
2. วีเกอร์ ยู และ ฮิลซ์ เอช. ไบโอเคมชีวฟิสิกส์ความละเอียดชุมชน(1971);44:513.
3. ฮิลซ์, เอช.และคณะยูโรเจ. ไบโอเคม.(1975);56:103–108.
4. แซมบรูค เจet อัล. การโคลนระดับโมเลกุล: คู่มือห้องปฏิบัติการ ฉบับที่ 2, Cold Spring Harborสำนักพิมพ์ห้องปฏิบัติการ Cold Spring Harbor (1989)
ตัวเลข
รูปที่.1 เหมาะสมที่สุด pH
สารละลายบัฟเฟอร์ 100mM:pH6.0-8.0, นา-ฟอสเฟต;pH8.0-9.0, ทริส-HCl;pH9.0-12.5, ไกลซีน-NaOH.ความเข้มข้นของเอนไซม์:1มก./มล
รูปที่ 2 อุณหภูมิที่เหมาะสม
ปฏิกิริยาในบัฟเฟอร์ K-ฟอสเฟต 20 มิลลิโมลาร์ pH 8.0ความเข้มข้นของเอนไซม์: 1 มก./มล
รูปที่ 3 ค่า pH ความมั่นคง
25 ℃, การบำบัด 16 ชม. ด้วยสารละลายบัฟเฟอร์ 50 มิลลิโมลาร์: pH 4.5- 5.5, อะซิเตต;pH 6.0-8.0, นา-ฟอสเฟต;pH 8.0-9.0, ทริส-เอชซีแอลpH 9.0-12.5, ไกลซีน-NaOHความเข้มข้นของเอนไซม์: 1 มก./มล
รูปที่ 4 ความร้อน ความมั่นคง
การบำบัด 30 นาทีด้วยบัฟเฟอร์ Tris-HCl 50 มิลลิโมลาร์, pH 8.0ความเข้มข้นของเอนไซม์: 1 มก./มล
รูปที่ 5 การจัดเก็บ เสถียรภาพty at 25 ℃
