M-MLV Reverse Transcriptase
RevScript Reverse transcriptase ได้มาจากเทคโนโลยีพันธุวิศวกรรมมีความสามารถในการสังเคราะห์ cDNA ที่สูงขึ้น ความเสถียรทางความร้อน และขีดจำกัดอุณหภูมิปฏิกิริยา (สูงถึง 60°C)ผลิตภัณฑ์ cDNA สังเคราะห์มีขนาดสูงสุด 10 kbช่วยเพิ่มความสัมพันธ์ของเทมเพลตและเหมาะสำหรับการถอดรหัสเทมเพลต RNA แบบย้อนกลับที่มีโครงสร้างรองที่ซับซ้อนหรือมียีนการคัดลอกต่ำ
ส่วนประกอบ
| ส่วนประกอบ | HC2003B (10,000U) | HC2003B (5*10,000U) | HC2003B (200,000U) |
| RevScript Reverse Transcriptase (200U/μL) | 50 ไมโครลิตร | 5×50 ไมโครลิตร | 1 มล |
| 5 × บัฟเฟอร์ RevScript | 250 ไมโครลิตร | 1.25 มล | 5 มล |
สภาพการเก็บรักษา
ผลิตภัณฑ์นี้ควรเก็บไว้ที่อุณหภูมิ -25°C~-15°C เป็นเวลา 2 ปี
คำจำกัดความของหน่วย
หนึ่งหน่วยรวม dTTP 1 นาโนโมลเข้าไปในวัสดุที่ไม่ละลายกรดในเวลา 10 นาทีที่ 37°C โดยใช้ Oligo(dT) เป็นไพรเมอร์
การตั้งค่าปฏิกิริยา
1.การเปลี่ยนสภาพของเทมเพลต RNA (ขั้นตอนนี้เป็นทางเลือก การเปลี่ยนสภาพของเทมเพลต RNA ช่วยในการเปิดโครงสร้างรอง ซึ่งจะปรับปรุงผลผลิตของ cDNA สายแรก)
| ส่วนประกอบ | ปริมาณ (ไมโครลิตร) |
| RNase ฟรี ddH2O | ถึง 13 |
| โอลิโก(dT)18 (50 ไมโครโมล/ลิตร) หรือไพรเมอร์แบบสุ่ม (50 ไมโครโมล/ลิตร) หรือไพรเมอร์เฉพาะยีน (2 ไมโครโมล/ลิตร) | 1 |
| หรือ 1 | |
| หรือ 1 | |
| แม่แบบอาร์เอ็นเอ | X a |
หมายเหตุ:
1) ก: RNA ทั้งหมด: 1-5 ug หรือ mRNA: 1-500 ng
2) ฟักที่อุณหภูมิ 65°C เป็นเวลา 5 นาที จากนั้นจึงนำไปวางบนน้ำแข็งทันทีเพื่อให้เย็นเป็นเวลา 2 นาทีการหมุนเหวี่ยงสั้นๆ เพื่อรวบรวมของเหลวที่ทำปฏิกิริยา เติมสารละลายปฏิกิริยาการถอดรหัสแบบย้อนกลับตามที่แสดงในตารางต่อไปนี้ปิเปตเบาๆ เพื่อผสม
1.การเตรียมของผสมปฏิกิริยา (ปริมาตร 20 ไมโครลิตร)
| ส่วนประกอบ | ปริมาณ (ไมโครลิตร) |
| ส่วนผสมของขั้นตอนก่อนหน้า | 13 |
| 5×บัฟเฟอร์ | 4 |
| dNTP มิกซ์ (10 นาโนโมล/ลิตร) | 1 |
| Reverse Transcriptase (200 U/μL) | 1 |
| สารยับยั้ง RNase (40 U/μL) | 1 |
1.ทำปฏิกิริยาภายใต้เงื่อนไขต่อไปนี้:
| อุณหภูมิ (°ซ) | เวลา |
| 25 องศาเซลเซียสa | 5 นาที |
| 42 องศาเซลเซียสb | 15-30 นาที |
| 85 องศาเซลเซียสc | 5 นาที |
หมายเหตุ:
1) ก.จำเป็นต้องฟักที่อุณหภูมิ 25°C เป็นเวลา 5 นาทีสำหรับการใช้เฮกซาเมอร์แบบสุ่มเท่านั้นโปรดข้ามขั้นตอนนี้เมื่อใช้ Oligo (dT)18หรือไพรเมอร์เฉพาะยีน
2)ข.อุณหภูมิการถอดรหัสย้อนกลับที่แนะนำคือ 42°C สำหรับเทมเพลตที่มีโครงสร้างทุติยภูมิที่ซับซ้อนหรือมีเนื้อหา GC สูง แนะนำให้เพิ่มอุณหภูมิปฏิกิริยาเป็น 50-55°C
3) ค.ให้ความร้อนที่ 85°C เป็นเวลา 5 นาทีเพื่อหยุดการทำงานของ Reverse Transcriptase
4) ผลิตภัณฑ์สามารถนำมาใช้โดยตรงในปฏิกิริยา PCR หรือ qPCR หรือเก็บไว้ที่อุณหภูมิ -20°C สำหรับการจัดเก็บระยะสั้นแนะนำให้แบ่งส่วนผลิตภัณฑ์และเก็บที่อุณหภูมิ -80°C เพื่อการเก็บรักษาในระยะยาวหลีกเลี่ยงการแช่แข็ง-ละลายบ่อยๆ
5) ผลิตภัณฑ์นี้เหมาะสำหรับ RT-qPCR แบบขั้นตอนเดียว แนะนำให้เพิ่ม Reverse Transcriptase 10-20 U สำหรับทุก ๆ ระบบปฏิกิริยา25μL หรือค่อยๆ เพิ่มปริมาณ Reverse Transcriptase ตามสถานการณ์จริง
หมายเหตุ
1.โปรดรักษาพื้นที่ทดลองให้สะอาดควรสวมถุงมือและหน้ากากที่สะอาดระหว่างการทำงานวัสดุสิ้นเปลืองทั้งหมดที่ใช้ในการทดลองควรปราศจาก RNase เพื่อป้องกันการปนเปื้อนของ RNase
2.ขั้นตอนทั้งหมดควรดำเนินการบนน้ำแข็งเพื่อป้องกันการย่อยสลาย RNA
3.แนะนำให้ใช้ตัวอย่าง RNA คุณภาพสูงเพื่อให้แน่ใจว่าการถอดรหัสแบบย้อนกลับมีประสิทธิภาพสูง
4.ผลิตภัณฑ์นี้ใช้สำหรับการวิจัยเท่านั้น
5.โปรดใช้งานด้วยเสื้อกาวน์แล็บและถุงมือแบบใช้แล้วทิ้ง เพื่อความปลอดภัยของคุณ
