RTL Reverse Transcriptase
RTL Reverse transcriptase เป็น DNA polymerase ที่ขึ้นกับเทมเพลต RNA ซึ่งขาดกิจกรรม exonuclease 3'→5' และมีกิจกรรม RNase Hเอนไซม์นี้สามารถใช้ RNA เป็นเทมเพลตในการสังเคราะห์สายเสริมของ DNA ซึ่งสามารถนำไปใช้กับการสังเคราะห์ cDNA สายแรกได้ โดยเฉพาะอย่างยิ่งสำหรับ RT-LAMP (การขยายความร้อนใต้พิภพแบบพึ่งสื่อกลาง)เมื่อเปรียบเทียบกับ RTL Reverse Transcriptase 1.0 ความไวจะดีขึ้นอย่างมีนัยสำคัญ เสถียรภาพทางความร้อนแข็งแกร่งขึ้น และปฏิกิริยาที่ 65°C มีความเสถียรมากกว่าสามารถใช้ RTL Reverse Transcriptase (ปราศจากกลีเซอรอล) เพื่อเตรียมการเตรียมแบบไลโอฟิไลซ์, รีเอเจนต์ RT-LAMP ที่ถูกไลโอฟิไลซ์ เป็นต้น
คำจำกัดความของหน่วย
หนึ่งหน่วยจะรวม dTTP 1 นาโนโมลเข้าไปในวัสดุที่ตกตะกอนด้วยกรดได้ในเวลา 20 นาทีที่อุณหภูมิ 50°C โดยใช้โพลี(A)•โอลิโก(dT)25 เป็นไพรเมอร์เทมเพลต
ส่วนประกอบ
| ส่วนประกอบ | HC5008A-01 | HC5008A-02 | HC5008A-03 |
| RTL Reverse Transcriptase (ปราศจากกลีเซอรอล) (15U/μL) | 0.1 มล | 1 มล | 10 มล |
| บัฟเฟอร์ RTL 10×HC | 1.5 มล | 4×1.5 มล | 5×10 มล |
| MgSO4 (100mM) | 1.5 มล | 2×1.5 มล | 3×10 มล |
สภาพการเก็บรักษา
การขนส่งภายใต้อุณหภูมิ 0°C และเก็บไว้ที่ -25°C~-15°C
ควบคุมคุณภาพ
- กิจกรรมคงเหลือของEเอ็นดอนนิวคลีเอส:ปฏิกิริยา 50 ไมโครลิตรที่ประกอบด้วย 1 ไมโครกรัมของ แลมดีเอ็นเอ และ 15 ยูนิตของ RTL2.0 ที่ถูกบ่มเป็นเวลา 16 ชั่วโมงที่ 37 ℃ แสดงรูปแบบเดียวกันกับการควบคุมเชิงลบโดยเจลอิเล็กโตรโฟรีซิส
- กิจกรรมคงเหลือของเอ็กโซนิวคลีเอส:ปฏิกิริยา 50 ไมโครลิตรที่ประกอบด้วย Hind Ⅲ ที่ถูกย่อย γDNA 1 ไมโครกรัม และ RTL2.0 15 ยูนิตที่ถูกบ่มเป็นเวลา 16 ชั่วโมงที่ 37 ℃ แสดงรูปแบบเดียวกันกับการควบคุมเชิงลบโดยเจลอิเล็กโตรโฟรีซิส
- กิจกรรมคงเหลือของนิเคส:ปฏิกิริยา 50 ไมโครลิตรที่ประกอบด้วย pBR322 คอยล์ยิ่งยวด 1 ไมโครกรัม และ RTL2.0 15 ยูนิตที่ถูกบ่มเป็นเวลา 4 ชั่วโมงที่ 37°C แสดงรูปแบบเดียวกันกับการควบคุมเชิงลบโดยเจลอิเล็กโทรโฟเรซิส
- กิจกรรมคงเหลือของอาร์เนส:ปฏิกิริยา 10 ไมโครลิตรที่ประกอบด้วย MS2 RNA 0.48 ไมโครกรัม และ RTL2.0 15 ยูนิตที่ถูกบ่มเป็นเวลา 4 ชั่วโมงที่ 37°C แสดงรูปแบบเดียวกันกับการควบคุมเชิงลบโดยเจลอิเล็กโทรโฟเรซิส
- อี. โคไล gดีเอ็นเอ:วัดกันด้วยอีโคไลชุดตรวจจับ HCD เฉพาะ RTL2.0 15 ยูนิตมีน้อยกว่า 1อี. โคไลจีโนม
การตั้งค่าปฏิกิริยา
โปรโตคอลการสังเคราะห์ cDNA
| ส่วนประกอบ | ปริมาณ |
| เทมเพลต RNA | ไม่จำเป็น |
| Oligo(dT) 18~25(50uM) หรือไพรเมอร์ผสมแบบสุ่ม (60uM) | 2 ไมโครลิตร |
| dNTP มิกซ์ (แต่ละอัน 10mM) | 1 ไมโครลิตร |
| สารยับยั้ง RNase (40U/uL) | 0.5 ไมโครลิตร |
| RTL Reverse Transcriptase 2.0 (15U/uL) | 0.5 ไมโครลิตร |
| บัฟเฟอร์ RTL 10×HC | 2 ไมโครลิตร |
| น้ำที่ปราศจากนิวเคลียร์ | มากถึง 20 ไมโครลิตร |
หมายเหตุ:
1) ปริมาณที่แนะนำของ Total RNA คือ 1ng~1μg
2) ปริมาณ mRNA ที่แนะนำคือ 50ng~100ng
เทอร์โม-เงื่อนไขการปั่นจักรยานสำหรับกิจวัตรประจำวัน ปฏิกิริยา:
| อุณหภูมิ (°ซ) | เวลา |
| 25 องศาเซลเซียสa | 5 นาที |
| 55 องศาเซลเซียส | 10 นาทีb |
| 80 องศาเซลเซียส | 10 นาที |
หมายเหตุ:
1) ถ้าใช้ Random Primer Mix ให้ขั้นฟักที่อุณหภูมิ 25°C
2) หากใช้ส่วนผสมไพรเมอร์เป้าหมาย ขั้นตอนการฟักตัวที่ 55°C เป็นเวลา 10~30 นาที
โปรโตคอล RT-LAMP
| ส่วนประกอบ | ปริมาณ | ความเข้มข้นสุดท้าย |
| เทมเพลต RNA | ไม่จำเป็น | ≥10สำเนา |
| dNTP มิกซ์ (10mM) | 3.5 ไมโครลิตร | 1.4 มม |
| ไพรเมอร์ FIP/BIP (25×) | 1 ไมโครลิตร | 1.6 ไมโครโมลาร์ |
| ไพรเมอร์ F3/B3 (25×) | 1 ไมโครลิตร | 0.2 ไมโครโมลาร์ |
| ไพรเมอร์ LoopF/LoopB (25×) | 1 ไมโครลิตร | 0.4 ไมโครโมลาร์ |
| สารยับยั้ง RNase (40U/μL) | 0.5 ไมโครลิตร | 20 U/ปฏิกิริยา |
| RTL Reverse Transcriptase 2.0 (15U/μL) | 0.5 ไมโครลิตร | 7.5 U/ปฏิกิริยา |
| Bst V2 DNA โพลีเมอเรส (8U/μL) | 1 ไมโครลิตร | 8 U/ปฏิกิริยา |
| MgSO4 (100mM) | 1.5 ไมโครลิตร | 6 มม. (รวม 8 มม.) |
| บัฟเฟอร์ 10×HC Bst V2 (หรือ 10×HC Bst V2 บัฟเฟอร์) | 2.5 ไมโครลิตร | 1 × (2มิลลิโมลาร์มก.2+) |
| น้ำที่ปราศจากนิวเคลียร์ | มากถึง 25 ไมโครลิตร | - |
หมายเหตุ:
1) ผสมโดยการหมุนเหวี่ยงและปั่นแยกเป็นเวลาสั้นๆ เพื่อรวบรวมฟักที่อุณหภูมิคงที่ 65°C เป็นเวลา 1 ชั่วโมง
2) บัฟเฟอร์ทั้งสองทำงานร่วมกันได้และมีองค์ประกอบเหมือนกัน
หมายเหตุ
1.ผลิตภัณฑ์นี้จะเกิดเป็นของแข็งสีขาวเมื่อเก็บไว้ที่อุณหภูมิ -20 °Cนำออกจากอุณหภูมิ -20°C แล้วนำไปวางบนน้ำแข็งประมาณ 10 นาทีหลังจากละลายแล้วสามารถนำไปใช้โดยการเขย่าและผสมได้
2.ผลิตภัณฑ์ cDNA สามารถเก็บไว้ที่อุณหภูมิ -20°C หรือ -80°C หรือใช้ทันทีสำหรับปฏิกิริยา PCR
3.เพื่อป้องกันการปนเปื้อนของ RNase โปรดรักษาพื้นที่ทดลองให้สะอาด และสวมถุงมือและหน้ากากที่สะอาดระหว่างการดำเนินการ
