Hotstart Taq DNA Polymerase
Hot Start Taq DNA Polymerase (การดัดแปลงแอนติบอดี) เป็น DNA polymerase ที่ทนความร้อนได้แบบ hot-start จาก Thermus Aquaticus YT-1 ซึ่งมีฤทธิ์ของพอลิเมอเรส 5′→3′ และกิจกรรม 5′ flap endonucleaseTaq DNA polymerase ที่เริ่มต้นโดยด่วนคือ Taq DNA polymerase ซึ่งดัดแปลงโดยแอนติบอดี Taq ที่ทนความร้อนการปรับเปลี่ยนแอนติบอดีเพิ่มความจำเพาะ ความไว และผลผลิตของ PCR
ส่วนประกอบ
| ส่วนประกอบ | HC1012เอ-01 | HC1012เอ-02 | HC1012เอ-03 | HC1012เอ-04 |
| 5×HC Taq บัฟเฟอร์ | 4×1 มล | 4×10 มล | 4×50 มล | 5×400มล |
| Hot Start Taq DNA Polymerase (แอนติบอดีดัดแปลง) (5 U/μL) | 0.1 มล | 1 มล | 5 มล | 10×5 มล |
การใช้งาน
Tris-HCl 10 มิลลิโมลาร์ (pH 7.4 ที่ 25°), KCl 100 มิลลิโมลาร์, EDTA 0.1 มิลลิโมลาร์, ไดไทโอไทรทอล 1 มิลลิโมลาร์, ทวีน 20 0.5%, IGEPALCA-630 0.5% และกลีเซอรอล 50%
สภาพการเก็บรักษา
การขนส่งภายใต้อุณหภูมิ 0°C และเก็บไว้ที่ -25°C~-15°C
คำจำกัดความของหน่วย
หนึ่งหน่วยหมายถึงปริมาณของเอนไซม์ที่รวม dNTP 15 nmol ลงในวัสดุที่ไม่ละลายกรดในเวลา 30 นาทีที่อุณหภูมิ 75°C
ควบคุมคุณภาพ
1.Endกิจกรรมโอนิวคลีส:การบ่มเอนไซม์ 20 U ด้วย pUC19 DNA 4 ไมโครกรัมเป็นเวลา 4 ชั่วโมงที่ 37°C ส่งผลให้ตรวจไม่พบการย่อยสลายของ DNA ตามที่กำหนดโดยเจลอิเล็กโตรโฟรีซิส
2.PCR แลมบ์ดา 5 กิโลไบต์:การขยาย PCR 25 รอบของ DNA Lambda 5 ng พร้อมด้วย Taq DNA Polymerase 1.25 ยูนิต โดยมี dNTP 200 µM และไพรเมอร์ 0.2 µM ส่งผลให้ได้ผลิตภัณฑ์ขนาด 5 kb ที่คาดหวัง
3.กิจกรรมเอ็กโซนิวคลีเอส:การฟักตัวของปฏิกิริยา 50 µl ที่มี Taq DNA Polymerase ขั้นต่ำ 12.5 U พร้อมด้วยโอลิโกนิวคลีโอไทด์ 10 nmol 5′-FAM เป็นเวลา 30 นาทีที่ 37°C ทำให้ไม่มีการย่อยสลายที่ตรวจพบได้
4.กิจกรรมอาร์เนส:การฟักตัวของปฏิกิริยา 10 ไมโครลิตรที่มีเอนไซม์ 20 ยูอาร์พร้อมการถอดรหัส RNA 1 ไมโครกรัมเป็นเวลา 2 ชั่วโมงที่ 37°ซ ส่งผลให้เกิดการเสื่อมสลายที่ตรวจพบไม่ได้ของ RNA ตามที่กำหนดหาโดยเจลอิเล็กโตรโฟรีซิส
5.การยับยั้งความร้อน:เลขที่
ระบบปฏิกิริยา
| ส่วนประกอบ | ปริมาณ |
| แม่แบบดีเอ็นเอa | ไม่จำเป็น |
| ไพรเมอร์ฟอร์เวิร์ด 10 μM | 0.5 ไมโครลิตร |
| ไพรเมอร์ย้อนกลับ 10 μM | 0.5 ไมโครลิตร |
| dNTP มิกซ์ (แต่ละอัน 10mM) | 0.5 ไมโครลิตร |
| 5×HC Taq บัฟเฟอร์ | 5 ไมโครลิตร |
| แทค ดีเอ็นเอ โพลีเมอเรสข(5U/ไมโครลิตร) | 0.125 ไมโครลิตร |
| น้ำที่ปราศจากนิวเคลียร์ | มากถึง 25 ไมโครลิตร |
หมายเหตุ:
1) ก.
| ดีเอ็นเอ | จำนวน |
| จีโนม | 1 นาโนกรัม-1 ไมโครกรัม |
| พลาสมิดหรือไวรัส | 1 pg-1 ง |
2)ข.ความเข้มข้นที่เหมาะสมที่สุดของ Taq DNA Polymerase อาจอยู่ในช่วง 5-50 ยูนิต/มิลลิลิตร (0.1-0.5 ยูนิต/ปฏิกิริยา 25 µL) ในการใช้งานเฉพาะด้าน
โปรโตคอลการหมุนเวียนความร้อน
พีซีอาร์
| ขั้นตอน | อุณหภูมิ-องศาเซลเซียส) | เวลา | รอบ |
| การเสียสภาพเบื้องต้นa | 95 ℃ | 1-3 นาที | - |
| การเสียสภาพ | 95 ℃ | 15-30 วิ | 30-35 รอบ |
| การหลอมข | 45-68 ℃ | 15-60 วิ | |
| ส่วนขยาย | 68 ℃ | 1kb/นาที | |
| ส่วนขยายสุดท้าย | 68 ℃ | 5 นาที | - |
หมายเหตุ:
1) การสูญเสียสภาพเริ่มต้น 1 นาทีที่ 95°C เพียงพอสำหรับการขยายเสียงส่วนใหญ่สำหรับเทมเพลตที่ยาก แนะนำให้ทำให้เสียสภาพนานขึ้น 2-3 นาทีที่อุณหภูมิ 95°Cด้วย PCR แบบโคโลนี แนะนำให้ทำการสูญเสียสภาพธรรมชาติเป็นเวลา 5 นาทีที่อุณหภูมิ 95°C
2) ขั้นตอนการหลอมโดยทั่วไปคือ 15-60 วินาทีอุณหภูมิในการหลอมจะขึ้นอยู่กับ Tm ของคู่ไพรเมอร์ และโดยทั่วไปจะอยู่ที่ 45-68°C
